發(fā)布時間：2020-10-10 09:18

　　 前言 神經(jīng)組織中的神經(jīng)絲(neurofilament NF)作為細(xì)胞骨架中間絲的一種，是極為復(fù)雜和特殊的成分。它與其它中間絲不同，在結(jié)構(gòu)和功能上是與微管密不可分的。構(gòu)成神經(jīng)元胞體細(xì)胞骨架主體的是微管和神經(jīng)絲，二者相互纏繞成神經(jīng)原纖維，而構(gòu)成軸突主體的只是神經(jīng)絲。它不僅起支持細(xì)胞的作用，決定細(xì)胞的形狀，還參與一些細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的運動，如物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換、細(xì)胞分化、細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞器在胞內(nèi)分布及跨膜信號的傳遞等一系列重要的生物學(xué)過程。其外接質(zhì)膜，內(nèi)連核表面和核基質(zhì)，中間又與微管、微絲及其它細(xì)胞器廣泛聯(lián)系，因而在胞質(zhì)內(nèi)形成了一個完整的網(wǎng)架系統(tǒng)。 SDS電泳表明神經(jīng)絲蛋白分為：200KD，160KD，68KD三種，分別稱NF-H，NF-M，NF-L。免疫電鏡研究三種蛋白的重組表明：P68聚合成主干，P200與P160則在P68構(gòu)成的主干上呈螺旋狀攀繞，并形成中間架橋的側(cè)突。從發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)角度上看，NF-L與NF-M首先在周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中出現(xiàn)，以后NF-H才逐漸出現(xiàn)，是神經(jīng)元成熟的標(biāo)志。此時NF-H在相臨的NF之間或NF與微管之間形成橫橋，使軸突的結(jié)構(gòu)變的更穩(wěn)定。 因NF衛(wèi)對神經(jīng)元具有代表性，故本實驗主要側(cè)重于對NF舊的研 究。 神經(jīng)元中線狀溶酶體（ematolysosome NLY）的存在與神經(jīng)元 的功能有著密切的關(guān)聯(lián)。軸突內(nèi)不能合成的所需物質(zhì)，可以通過 溶酶體及其前體實現(xiàn)軸漿運輸。有關(guān)線狀溶酶體與神經(jīng)絲的關(guān)系 目前還不清楚，對于神經(jīng)絲功能的了解也還處于摸索階段。 傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為NLY與微管有關(guān)，與中間絲無關(guān)。這是因為 應(yīng)用微管解聚藥后，溶酶體的分布發(fā)生了變化，殊不知由于中間絲 的構(gòu)建對微管有依賴作用，解聚藥同時也破壞了中間絲的結(jié)構(gòu)，已 有人證實應(yīng)用秋水仙素后中間絲的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。 為了證實神經(jīng)絲的確對NLY的形狀與分布有影響，采用優(yōu)先 解聚神經(jīng)絲的藥物一釩酸鹽。釩酸鹽是一種小分子，容易通透細(xì) 胞膜，低濃度的釩酸鹽被認(rèn)為是具有模擬胰島素的第二類作用，也 是酪氨酸磷酸酶（IyTtn ase）的抑制劑，它可以使神經(jīng)絲過度磷酸 化，降解為小分子，破壞其整體結(jié)構(gòu)。 本實驗主要采用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)方法觀察神經(jīng)絲蛋白NFA從 發(fā)育初期到成熟期間表達量的變化，以NFA的分布代表神經(jīng)絲 的分布，觀察應(yīng)用釩酸鹽破壞神經(jīng)絲的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)及引發(fā)的線狀 溶酶體形狀與分布的改變，推測NF0的磷酸化、神經(jīng)絲的解聚。 胞漿鈣離子及物質(zhì)、信號傳遞的關(guān)系與機制。 目前有關(guān)神經(jīng)絲的研究主要集中在蛋白三維重建山NA模型 及基因結(jié)構(gòu)等方面，對于其功能的研究尚處于猜想和推測階段。 如果證實神經(jīng)絲的完整性對于神經(jīng)元的物質(zhì)運輸，特別是關(guān)于線 狀溶酶體的軸漿轉(zhuǎn)運起著不可缺少的作用，對于研究人類神經(jīng)系 統(tǒng)退行性病變都將有所啟示。 ·2· 材料與方法 1．神經(jīng)絲蛋白NF－H的發(fā)育特性： 細(xì)胞培養(yǎng)：健康WSfor大鼠新生鼠，出生1天，由中國醫(yī)科大 學(xué)實驗動物部提供。斷頸處死，取出脊髓，用DMEM培養(yǎng)基（含 10％胎牛血清＊ 青霉素＊ 牙Inl鏈霉素＊ HEPES） 培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞密度為 10 X 10’M毫升，接種于涂有鼠尾膠的蓋 玻片或聚苯乙烯薄膜上，置于含有 5％CO。的孵箱中，37℃下分別 培養(yǎng)至五、七、九、十一、十三天。免疫組化：將蓋玻片用 Hank k液 漂洗，冷丙酮固定 5分鐘，1％Titon X－100作用 10分鐘。漂洗后 用正常血清封閉液室溫作用20分鐘。將抗小鼠單克隆抗體200 （NTh00）稀釋成 1：300，4℃作用過夜，對照組以朋S代替一抗孵 育，用生物素標(biāo)記的二抗室溫作用60分鐘，再用0．02MPBS漂洗， SABC室溫作用60分鐘，漂洗。DAB扦p。作用10分鐘，封片，鏡 檢，作圖像分析定量測定，觀察不同培養(yǎng)天數(shù)的神經(jīng)元中NF0的 表達量是否有差異。在體脊髓切片取Wistar大鼠脊髓，用冰凍切 片機將組織塊切成15卜M厚的切片，以冷丙酮固定15分鐘，二阮 Tntm X－100作用 10分鐘。漂洗后用 3％HZO。室溫作用 10分鐘， 正常血清封閉液室溫作用10分鐘，其余操作同上。作圖象分析， 以提供參考值。 2．釩酸鹽對NF衛(wèi)的影響及5！發(fā)NLY的改變： 將培養(yǎng)十一天的脊髓神經(jīng)元隨機分成四組／組：正常組人 組：力人10kM 正釩酸鈉（調(diào)節(jié)PH為7．2），50pl／子，12小時＊ 組：加人上述正釩酸鈉，50ptr孔＊ 小時后換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng) 12小時刀組：加人上述正釩酸鈉，50pL／孔，24小時。 免疫細(xì)胞化學(xué)操作及電鏡技術(shù)：免疫熒光法一將蓋玻片用冷 丙酮固定5分鐘，漂洗后用正常血清封閉液室溫作用10分鐘。將 ·3· 抗小鼠單克隆抗體 200（NTh00）稀釋成 1：300，4℃作用過夜，對照 組以＊鵬代替一抗孵育，S＊SC h抗以1：10o稀釋，37℃孵育2 ／J’ 時，再加人 SABCCy3（稀釋成 1：1皿L4℃暗箱作用 60分鐘，用 0． 02MPBS漂洗約30分鐘。以 PBS封固，熒光顯微鏡檢測免疫組化 結(jié)果。SABC免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)一光鏡操作同上。電鏡操作將聚 苯
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R329
【文章目錄】：
一、 中文摘要
二、 英文摘要
三、 英文縮略語
四、 前言
五、 實驗材料
六、 實驗方法
七、 實驗結(jié)果
八、 討論
九、 結(jié)論
十、 論文圖片
十一、 參考文獻
十二、 致謝
十三、 個人簡介
十四、 在學(xué)期間發(fā)表論文及獲獎情況

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 米瑞發(fā),范明,周長滿;神經(jīng)絲磷酸化及其生理病理作用[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;1998年02期

2 朱茂祥，吳國利;人血紅細(xì)胞酪氨酸蛋白磷酸酶（PTPP）的研究Ⅱ·胞漿PTPP的分離純化及其主要性質(zhì)[J];生物化學(xué)雜志;1994年02期

本文編號：2835018