神經干細胞具有自我更新能力和多分化潛能，可分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等主要類型的神經細胞。雖然腦組織中存在這種具有持續(xù)分裂潛能的神經干細胞，但由于其數量少并缺乏足夠的正向刺激信號，在損傷條件下無法產生大量新生細胞；存在于成年腦組織內的神經干細胞取材困難；從胚胎干細胞誘導分化而來或直接從胎腦組織中分離而來的神經干細胞又涉及倫理及免疫排斥反應等問題，嚴重限制了神經干細胞的臨床應用。因此，尋找新的神經干細胞的來源對于神經科學領域基礎與臨床應用研究的發(fā)展有著重要意義。 間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)不僅能夠跨胚層向多種組織和細胞類型分化，并且在體外易于分離培養(yǎng)和擴增。這些特性使MSCs成為在細胞治療、基因治療中有效發(fā)揮作用的理想工程細胞。國內外已有較多實驗證明骨髓來源的MSCs(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)在體外可以分化為神經細胞。MSCs不僅存在于骨髓，也存在于臍血和外周血中。近期的研究表明臍血MSCs具有與骨髓MSCs相似的分化為神經細胞的功能。 端粒酶的適度低表達是臍血MSCs維持增殖能力的必要條件之一，端粒酶活性的高低可間接反映臍血MSCs的增殖能力和移植的安全性(無致瘤性)。本研究對重組人表皮生長因子(epithelium growth factor，EGF)和堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)聯合誘導人臍血MSCs體外向神經細胞分化過程中端 鄭州大學2004屆碩士研究生學位論文 EGF和bFGF聯合誘導人臍血Mscs向神經細胞分化過程中的端粒醉活性變化 粒酶活性變化進行檢測，以探討人臍血MSCs體外向神經細胞分化過程中的增殖性 和安全性，為其臨床應用提供實驗和理論依據。 方法: 采集健康自然分娩產婦志愿捐獻的臍血，用PBs(P H 7.4)進行l(wèi):l稀釋，密 度梯度離心分離單個核細胞(mononuelear eells，MNCs)，PBS洗滌2次后重懸于 含20%胎牛血清的DMEM/F12中，苔盼藍染色計數，調整細胞數后，接種于T一75 培養(yǎng)瓶內(細胞密度為1 x 106/m1)，一組不加細胞因子，另一組加入EGF和bFGF， 終濃度各為10ng/ml，剩余細胞用液氮凍存。培養(yǎng)24h傾去全部液體以去除未貼壁 細胞，以后每3d全量換液一次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。分別收集培養(yǎng) ld、4d、7d、10d、14d、Zld的貼壁細胞和凍存細胞，PBS洗滌后計數活細胞，將 細胞密度調整一致，采用反轉錄多聚酶鏈反應(reverse一transcript polymerase chain reaction，RT一PCR)方法檢測臍血MSCs培養(yǎng)前后各時IbJ段的巢蛋白(nestin)、神經 絲亞單位M(neurofilament Sub儷tM，NF一M)和人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase:everse transedPtase，hTERT)mRNA表達;采用端粒重復序列擴增法 (telomerer即eat田的plifieation protoeal assay，TRAp)一酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 法檢測人臍血MSCS向神經細胞分化過程中的端粒酶活性變化。 結果: 1.RI飛PCR檢測發(fā)現，未培養(yǎng)的臍血細胞nestin、NF一M、hTERT mRNA均表達 陽性。培養(yǎng)后nestin、hTERT mRNA二者表達隨培養(yǎng)時間延長而下降，至第7d已 不能檢出;而NF一M mRNA的表達隨培養(yǎng)時間延長而增強。細胞因子組與對照組 相比，細胞因子能促進NF一M mRNA的表達，能延緩nestin、hTERTmRNA表達的 下降趨勢。 2.TRAP(PCR)一ELISA法檢測發(fā)現，未培養(yǎng)的臍血細胞端粒酶活性較高，以 后隨培養(yǎng)時間的延長而下降(尸0.01)，至培養(yǎng)第Zld后已不能檢出。細胞因子組與 對照組相比，細胞因子能延緩端粒酶活性的降低趨勢(P0.01)。 結論: 1.細胞因子EGF和bFGF能聯合誘導臍血MSCs向神經細胞分化。 2.細胞因子EGF和bFGF在聯合誘導臍血MSCs分化為神經細胞的過程中，能 下調hTERI，mRNA的表達。 鄭州大學2側)4屆碩士研究生學位論文 EGF和bFGF聯合誘導人臍血MSCs向神經細胞分化過程中的端粒醉活性變化 3.細胞因子EGF和bFGF在聯合誘導臍血MSCS向神經細胞分化的過程中，能 降低臍血MSCS的端粒酶活性。 4.本實驗為臍血MSCs移植治療神經系統(tǒng)疾病提供了安全方面的理論依據。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

屆碩士研究生學位論文EGF和bFGF聯合誘導人臍血MScs向神經細胞分化過NA的質量檢查有6%甲醛的瓊脂糖凝膠上進行電泳:取5閃加有載樣緩沖化乙錠(EB)、質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠中，在電壓后，置凝膠掃描成像系統(tǒng)下觀測結果并照相。能清楚地看到28SrRNA和18SrRNA兩條清晰的條帶，也.85rRNA和55rRNA組成的較模糊遷移較快的帶。285rRNA亮度的兩倍，且這兩條帶都沒有彌散現象，說明所提驗的要求133](見圖l)。

3.結果3.1倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)培養(yǎng)初期(24h)臍血MSCS胞體小呈圓形(見圖2)，以后逐漸變?yōu)闄E圓、胞體變大(4d)，向兩極伸出突起(7d)(見圖3)，對照組14d時長成梭形(見圖4);細胞因子組14d時長成成纖維狀細胞，突起伸出較長，有多個鄰近細胞的突起連成網狀，類似神經元(見圖5)。

3.1倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)培養(yǎng)初期(24h)臍血MSCS胞體小呈圓形(見圖2)，以后逐漸變?yōu)闄E圓、胞體變大(4d)，向兩極伸出突起(7d)(見圖3)，對照組14d時長成梭形(見圖4);細胞因子組14d時長成成纖維狀細胞，突起伸出較長，有多個鄰近細胞的突起連成網狀，類似神經元(見圖5)。

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

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本文編號：2829664