神經(jīng)干細胞具有自我更新能力和多分化潛能，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞等主要類型的神經(jīng)細胞。雖然腦組織中存在這種具有持續(xù)分裂潛能的神經(jīng)干細胞，但由于其數(shù)量少并缺乏足夠的正向刺激信號，在損傷條件下無法產(chǎn)生大量新生細胞；存在于成年腦組織內(nèi)的神經(jīng)干細胞取材困難；從胚胎干細胞誘導分化而來或直接從胎腦組織中分離而來的神經(jīng)干細胞又涉及倫理及免疫排斥反應等問題，嚴重限制了神經(jīng)干細胞的臨床應用。因此，尋找新的神經(jīng)干細胞的來源對于神經(jīng)科學領域基礎與臨床應用研究的發(fā)展有著重要意義。 間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)不僅能夠跨胚層向多種組織和細胞類型分化，并且在體外易于分離培養(yǎng)和擴增。這些特性使MSCs成為在細胞治療、基因治療中有效發(fā)揮作用的理想工程細胞。國內(nèi)外已有較多實驗證明骨髓來源的MSCs(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)在體外可以分化為神經(jīng)細胞。MSCs不僅存在于骨髓，也存在于臍血和外周血中。近期的研究表明臍血MSCs具有與骨髓MSCs相似的分化為神經(jīng)細胞的功能。 端粒酶的適度低表達是臍血MSCs維持增殖能力的必要條件之一，端粒酶活性的高低可間接反映臍血MSCs的增殖能力和移植的安全性(無致瘤性)。本研究對重組人表皮生長因子(epithelium growth factor，EGF)和堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)聯(lián)合誘導人臍血MSCs體外向神經(jīng)細胞分化過程中端 鄭州大學2004屆碩士研究生學位論文 EGF和bFGF聯(lián)合誘導人臍血Mscs向神經(jīng)細胞分化過程中的端粒醉活性變化 粒酶活性變化進行檢測，以探討人臍血MSCs體外向神經(jīng)細胞分化過程中的增殖性 和安全性，為其臨床應用提供實驗和理論依據(jù)。 方法: 采集健康自然分娩產(chǎn)婦志愿捐獻的臍血，用PBs(P H 7.4)進行l(wèi):l稀釋，密 度梯度離心分離單個核細胞(mononuelear eells，MNCs)，PBS洗滌2次后重懸于 含20%胎牛血清的DMEM/F12中，苔盼藍染色計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)后，接種于T一75 培養(yǎng)瓶內(nèi)(細胞密度為1 x 106/m1)，一組不加細胞因子，另一組加入EGF和bFGF， 終濃度各為10ng/ml，剩余細胞用液氮凍存。培養(yǎng)24h傾去全部液體以去除未貼壁 細胞，以后每3d全量換液一次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。分別收集培養(yǎng) ld、4d、7d、10d、14d、Zld的貼壁細胞和凍存細胞，PBS洗滌后計數(shù)活細胞，將 細胞密度調(diào)整一致，采用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(reverse一transcript polymerase chain reaction，RT一PCR)方法檢測臍血MSCs培養(yǎng)前后各時IbJ段的巢蛋白(nestin)、神經(jīng) 絲亞單位M(neurofilament Sub儷tM，NF一M)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase:everse transedPtase，hTERT)mRNA表達;采用端粒重復序列擴增法 (telomerer即eat田的plifieation protoeal assay，TRAp)一酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 法檢測人臍血MSCS向神經(jīng)細胞分化過程中的端粒酶活性變化。 結(jié)果: 1.RI飛PCR檢測發(fā)現(xiàn)，未培養(yǎng)的臍血細胞nestin、NF一M、hTERT mRNA均表達 陽性。培養(yǎng)后nestin、hTERT mRNA二者表達隨培養(yǎng)時間延長而下降，至第7d已 不能檢出;而NF一M mRNA的表達隨培養(yǎng)時間延長而增強。細胞因子組與對照組 相比，細胞因子能促進NF一M mRNA的表達，能延緩nestin、hTERTmRNA表達的 下降趨勢。 2.TRAP(PCR)一ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，未培養(yǎng)的臍血細胞端粒酶活性較高，以 后隨培養(yǎng)時間的延長而下降(尸0.01)，至培養(yǎng)第Zld后已不能檢出。細胞因子組與 對照組相比，細胞因子能延緩端粒酶活性的降低趨勢(P0.01)。 結(jié)論: 1.細胞因子EGF和bFGF能聯(lián)合誘導臍血MSCs向神經(jīng)細胞分化。 2.細胞因子EGF和bFGF在聯(lián)合誘導臍血MSCs分化為神經(jīng)細胞的過程中，能 下調(diào)hTERI，mRNA的表達。 鄭州大學2側(cè))4屆碩士研究生學位論文 EGF和bFGF聯(lián)合誘導人臍血MSCs向神經(jīng)細胞分化過程中的端粒醉活性變化 3.細胞因子EGF和bFGF在聯(lián)合誘導臍血MSCS向神經(jīng)細胞分化的過程中，能 降低臍血MSCS的端粒酶活性。 4.本實驗為臍血MSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了安全方面的理論依據(jù)。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

屆碩士研究生學位論文EGF和bFGF聯(lián)合誘導人臍血MScs向神經(jīng)細胞分化過NA的質(zhì)量檢查有6%甲醛的瓊脂糖凝膠上進行電泳:取5閃加有載樣緩沖化乙錠(EB)、質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠中，在電壓后，置凝膠掃描成像系統(tǒng)下觀測結(jié)果并照相。能清楚地看到28SrRNA和18SrRNA兩條清晰的條帶，也.85rRNA和55rRNA組成的較模糊遷移較快的帶。285rRNA亮度的兩倍，且這兩條帶都沒有彌散現(xiàn)象，說明所提驗的要求133](見圖l)。

3.結(jié)果3.1倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)培養(yǎng)初期(24h)臍血MSCS胞體小呈圓形(見圖2)，以后逐漸變?yōu)闄E圓、胞體變大(4d)，向兩極伸出突起(7d)(見圖3)，對照組14d時長成梭形(見圖4);細胞因子組14d時長成成纖維狀細胞，突起伸出較長，有多個鄰近細胞的突起連成網(wǎng)狀，類似神經(jīng)元(見圖5)。

3.1倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)培養(yǎng)初期(24h)臍血MSCS胞體小呈圓形(見圖2)，以后逐漸變?yōu)闄E圓、胞體變大(4d)，向兩極伸出突起(7d)(見圖3)，對照組14d時長成梭形(見圖4);細胞因子組14d時長成成纖維狀細胞，突起伸出較長，有多個鄰近細胞的突起連成網(wǎng)狀，類似神經(jīng)元(見圖5)。

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

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6 賈延R

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