流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，它對人類危害極大。目前對于流感尚無有效的治療手段，仍以疫苗接種為主，但由于流感病毒的抗原變異性強(qiáng)，當(dāng)前使用的三聯(lián)滅活疫苗效果并不理想，迫切需要研制具有交叉保護(hù)作用的新型疫苗。本文應(yīng)用噬菌體展示隨機(jī)肽庫技術(shù)對目前流感病毒的主要流行亞型H1N1和H3N2間有交叉保護(hù)作用的模擬表位進(jìn)行了篩選。主要實驗包括： 1．流感病毒模擬表位的篩選與鑒定 將原十二肽庫在大腸桿菌XL1-Blue中擴(kuò)增，經(jīng)PEG／NaCl沉淀純化，溶于TBS中。以抗H3N2流感病毒的多克隆抗體(100ng／μl)包被酶標(biāo)板，加入制備好的肽庫，用TBST洗去非特異結(jié)合的噬菌體，加0.2mol／L甘氨酸-鹽酸(pH2.2)，室溫放置10min以洗脫特異結(jié)合的噬菌體，2mol／L Tris-HCl(pH9.1)中和后，取2μl噬菌體接種大腸桿菌XL1-Blue菌進(jìn)行空斑滴定，其余噬菌體擴(kuò)增后用于下一輪篩選，共重復(fù)3輪淘洗�？瞻叩味@示淘洗過程中有明顯的富集趨勢。 山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 第三次淘洗的噬菌體感染大腸桿菌XLI一Blue，鋪制平板，隨機(jī) 挑取18個分離良好的噬斑，制備噬菌體原種。經(jīng)雙抗體(流感病毒 的多抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記M13噬菌體抗體)夾心ELISA鑒定的 陽性克隆有12個，分別將其純化、并進(jìn)行DNA序列分析。結(jié)果12 個陽性噬菌體遞呈膚中，有5個氨基酸序列完全相同，并且與流感病 毒的PBI、PA、Nsl蛋白有同源性，另2個氨基酸序列相同，其余 的5個氨基酸序列之間也有一定的相似性。提示陽性噬菌體遞呈膚可 能為流感病毒的模擬表位。并且在這12個陽性克隆中，有8個可特 異性的與HINI多抗結(jié)合，可能為二者共有的抗原表位口 2.模擬表位的免疫保護(hù)作用分析 根據(jù)模擬表位的序列相似性分3組免疫6周齡的雌性BALB/c小 鼠，10只/組，以野生噬菌體為陰性對照。將陽性的噬菌體克隆大量 擴(kuò)增、并測定蛋白濃度后，以100協(xié)留只的劑量皮下注射BALB/c小鼠， 間隔兩周加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫劑量為30林留只，共免疫3次。每次免 疫后尾部采血，檢測血清中的流感病毒特異抗體和抗體中的 IgGI/IgGZa比值，以確定免疫反應(yīng)的主要類型(ThZ/Thl)。二次免疫 后4組的血清抗體陽性率分別為72.7%、25.0%、33.3%和O%;三次 免疫后4組的血清抗體陽性率分別為90.9%、88.9%、85.7%和O%。 提示篩選出的表位可誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生。而血清中針對流感病毒的 IgGZa含量明顯高于IgGI，初步推斷模擬表位引起的免疫反應(yīng)是以Thl 引起的細(xì)胞免疫為主。 用9日齡雞胚培養(yǎng)人流感病毒的鼠肺適應(yīng)株戶JP側(cè)8/34(HINI)， 通過血凝實驗測得病毒滴度為1:320。以10一儀10一，八個稀釋度的病毒 鼻腔接種小鼠，0.lml/只，測定其小鼠半數(shù)致死量(LDS。)，結(jié)果為 山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 10一“25。第三次免疫兩周后，以sxLDS。的A/p側(cè)8/34(HINI)經(jīng)鼻 腔攻毒小鼠，觀察免疫噬菌體接種的保護(hù)作用，14d后四個組的生存 率分別為:40%、20%、40%和。%，而且免疫組小鼠死亡時間較對照 組明顯推后。結(jié)果顯示篩選的模擬表位有部分交叉保護(hù)作用。 通過以上實驗，篩選到具交叉免疫保護(hù)作用的甲型流感病毒模擬 表位，為流感疫苗的研制提供了新的思路和有益的線索。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R373
【部分圖文】：

段負(fù)鏈RNA病毒川，分為甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒的危害最為嚴(yán)重。其形狀常為球狀，直徑約80一120nm，絲狀體長可達(dá)數(shù)微米。其結(jié)構(gòu)分三層(見圖1)，由外到內(nèi)分別為:雙層類脂囊膜、球型蛋白殼和核殼體。囊膜來自病毒感染的宿主細(xì)胞，囊膜上散布著三種形態(tài)不同的蛋白突起:一種象三角形細(xì)長棒的稱為血凝素(HA)，另一種象蘑菇狀的稱為神經(jīng)氨酸酶(NA)，HA與NA在囊膜的比例為4:1，較小的一種叫MZ;中間層是類脂膜下面的基質(zhì)蛋白(MI)形成一個或若干個分子厚的球型蛋白殼;里層即裹在蛋白殼內(nèi)的核殼體，直徑9一15nm，包含核殼(即)、三種多聚酶蛋白(PBZ、pBI、PA)和病毒基因組RNA。RN只R卜‘氣g附nome十N戶O閃52圖1甲型流感病毒結(jié)構(gòu)圖

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉北一,李一,富寧,齊杰,王莉,于春雷;三種檢測噬菌體陽性克隆的ELISA比較[J];免疫學(xué)雜志;1998年01期

2 李全喜,王琰,李競,王雅明,徐建軍,王力民,董志偉;從噬菌體短肽庫中篩選單克隆抗體識別的抗原表位[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1997年01期

本文編號：2831393