目的 利用基因工程技術(shù)從人扁桃體細(xì)胞cDNA中克隆出IL-21編碼基因，將其N末端成熟片段編碼基因在原核細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá)，并進(jìn)行初步純化和抗原性檢測。 方法 以人扁桃體細(xì)胞經(jīng)PHA刺激的cDNA文庫為模板，經(jīng)PCR獲得IL-21全基因片段。測序確認(rèn)后，分別設(shè)計(jì)含BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物，經(jīng)PCR獲得IL-21成熟肽的編碼基因。將此IL-21基因插入表達(dá)載體pGEX 4T-2并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，重組克隆經(jīng)酶切與測序確認(rèn)后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。用瓊脂糖珠結(jié)合的純化和酶切方法，所得產(chǎn)物作蛋白印跡試驗(yàn)分析。 結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳顯示重組質(zhì)粒的PCR和雙酶切產(chǎn)物與理論大小相等。SDS-PAGE顯示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的大腸桿菌DH5α亦表達(dá)一與理論相符的條帶。目的蛋白約占總菌體蛋白的10％。并獲得了與理論值相符的純化條帶，在進(jìn)一步的蛋白印跡試驗(yàn)分析中發(fā)現(xiàn)表達(dá)的蛋白能與IL-2的單抗產(chǎn)生交叉反應(yīng)。 結(jié)論 我們構(gòu)建了人IL-21編碼基因克隆載體并獲得在大腸桿菌中的成功表達(dá)，同時(shí)建立了該蛋白的初步純化方法，通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了表達(dá)蛋白與IL-2之間結(jié)構(gòu)的相似性，結(jié)合國外最新研究預(yù)示了IL-21作為臨床一種新的調(diào)節(jié)免疫功能藥物的潛力。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖1PCR產(chǎn)物及重組質(zhì)粒①DLZ000Marker;②IL一21全長編碼基因;③IL一21成熟N末端編碼基因;④pGEX4T一2空質(zhì)粒;⑤酶切的pGEX4T一2空質(zhì)粒;⑥重組成功的pGEX4T一2八L一21質(zhì)粒測定性(白斑)的IL一21的全長編碼基因克隆送測序部(儀器為ABIP租SM377一%，測別用自帶引物進(jìn)行測通。測序結(jié)果顯示:預(yù)期一致，進(jìn)一步證明重組克隆成功。測序

經(jīng)PcR擴(kuò)增出的IL一21成熟膚的編碼基因片段，在酶切后插入質(zhì)粒pGEX4T-2，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒。堿裂解法提取重組克隆質(zhì)粒，首先用PCR初步鑒定重組質(zhì)粒;然后，將PCR鑒定重組成功的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后電泳(圖2)。4.重組質(zhì)粒pGEX4T一2/IL一21在E.eo11DH5a中的表達(dá)經(jīng)SDS一PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)R一250染色觀察，含重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)菌在4100oD。位置出現(xiàn)一蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在相應(yīng)位置的沒有蛋白條帶;含質(zhì)粒pGEX4T一2的誘導(dǎo)菌在26000Da位置出現(xiàn)一條帶。目的基因表達(dá)的多膚相對分子量估計(jì)為150O0Da，與融合蛋白共同表達(dá)相對分子質(zhì)量約為41000Da，與理論估計(jì)相一致。經(jīng)凝膠成像掃描，融合蛋白產(chǎn)量占總蛋白的10%。(圖3)圖3重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的SDS一PAGE①低分子量蛋白marker;②未誘導(dǎo)的空質(zhì)粒;③未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒;④誘導(dǎo)的空質(zhì)粒;⑤一⑦誘導(dǎo)1，2，4h的重組質(zhì)粒

與理論估計(jì)相一致。經(jīng)凝膠成像掃描，融合蛋白產(chǎn)量占總蛋白的10%。(圖3)圖3重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的SDS一PAGE①低分子量蛋白marker;②未誘導(dǎo)的空質(zhì)粒;③未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒;④誘導(dǎo)的空質(zhì)粒;⑤一⑦誘導(dǎo)1，2，4h的重組質(zhì)粒

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2828498