α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)屬外切糖苷酶類，在自然界中分布廣泛，可在體外水解糖復(fù)合物。 本課題組采用RT-PCR方法，從中國海南Catimor咖啡豆中克隆了α-半乳糖苷酶cDNA，全長1.1Kb，構(gòu)建了其表達載體，電穿孔法導(dǎo)入畢赤酵母GS115細胞，篩選出重組α-半乳糖苷酶菌株。離子交換層析純化出α-半乳糖苷酶，酶比活性從15U／mg提高到28.14U／mg。進一步鑒定了酶的生物化學(xué)性質(zhì)，其Km=0.275mmol／L，Vmax=0.014mmol／L／min。 本研究在此基礎(chǔ)上，嘗試了基因重組α-半乳糖苷酶菌株在5 L發(fā)酵罐中的表達擴增以及從發(fā)酵液中純化α-半乳糖苷酶的研究。并在pH=5.5-5.6、每mL紅細胞使用100U的基因重組α-半乳糖苷酶、26℃、2 h條件下，成功地清除了人B型紅細胞表面B抗原。 本研究著重開展了人B→O血型改造的動物實驗研究，首先分別用吸收放散法和常規(guī)血型檢測法篩選出合適的獼猴(rhesus monkey)和長臂猿(gibbon)，用批量制備的基因重組α-半乳糖苷酶對類人B型獼猴紅細胞(rhesus monkey red blood cells，rRBC)和B型長臂猿紅細胞(gibbon red blood cells，gRBC)表面抗原進行酶解，觀察B抗原清除情況以及酶解對紅細胞結(jié)構(gòu)和功能是否有影響；經(jīng)酶解后的B型紅細胞再回輸給類人A型獼猴和A型長臂猿，檢測經(jīng)α-半乳糖苷酶酶解后，供體紅細胞在受體動物體內(nèi)24h存活率和半衰期，觀察其能否正常存活；對受血動物的輸血安全性進行評價，分析回輸后急性、慢性輸血反應(yīng)；以及檢測受體動物體內(nèi)有無因α-半乳糖苷酶引起的α-半乳糖苷酶抗體產(chǎn)生。 實驗證明：用100U／ml的α-半乳糖苷酶對類人B型獼猴和B型長臂猿的紅細胞進行酶解，可以有效的清除獼猴紅細胞類人B抗原和長臂猿紅細胞B抗原；酶解后紅細胞結(jié)構(gòu)和功能未發(fā)生改變；回輸給類人A型獼猴和A型長臂猿后，經(jīng)α-半乳糖苷酶酶解的紅細胞在受體動物體內(nèi)24h存活率和半衰期與酶解前一致，符合FDA輸血標準；受血動物尿液和血液生化指標未發(fā)生明顯改變；受血動物體內(nèi)無α-半乳糖苷酶抗體產(chǎn)生。 總之，動物實驗充分證明使用酶解反應(yīng)后的通用O型血(Enzymatically 摘要 eonverted oroup 0 Red Blood eells，ECORBC)是安全的。動物實驗的成功為今 后申報B分O血型改造進入人體臨床輸血實驗觀察，奠定了重要基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
縮略詞表
摘要
Abstract
前言
第一部分 基因重組α-半乳糖苷酶制備及B→O血型改變的研究
    1.1 、 實驗材料
    1.2 、 實驗方法
        1.2.1 、 α-半乳糖苷酶活性測定
        1.2.2 、 發(fā)酵工藝流程
        1.2.3 、 發(fā)酵液定性與定量分析
        1.2.4 、 α-半乳糖苷酶的純化:
        1.2.5 、 α-半乳糖苷酶的鑒定
        1.2.6 、 人B型紅細胞的酶解改造
    1.3 、 實驗結(jié)果
        1.3.1 、 α-半乳糖苷酶的發(fā)酵
        1.3.2 、 發(fā)酵液中α-半乳糖苷酶的純化與鑒定
        1.3.3 、 應(yīng)用α-半乳糖苷酶進行人B→O血型改造
    1.4 討論
第二部分 α-半乳糖苷酶酶解獼猴紅細胞表面類人B抗原和長臂猿紅細胞表面B抗原
    2.1 、 實驗材料
    2.2 、 實驗方法
        2.2.1 、 獼猴實驗部分
            2.2.1.1 、 血樣采集與血型的鑒定
            2.2.1.2 、 α-半乳糖苷酶酶解獼猴紅細胞的類人B抗原
            2.2.1.3 、 α-半乳糖苷酶酶解獼猴紅細胞類人B抗原的鑒定
            2.2.1.4 、 α-半乳糖苷酶酶解對獼猴紅細胞結(jié)構(gòu)功能的影響
            2.2.1.5 、 酶解對獼猴紅細胞在體內(nèi)存活的影響
            2.2.1.6 、 酶解后獼猴紅細胞的輸血實驗
            2.2.1.7 、 酶解紅細胞回輸后免疫反應(yīng)的觀察
        2.2.2 長臂猿實驗部分
            2.2.2.1 、 長臂猿血樣采集與血型的鑒定
            2.2.2.2 、 α-半乳糖苷酶酶解長臂猿紅細胞的B抗原
            2.2.2.3 、 α-半乳糖苷酶酶解長臂猿紅細胞B抗原的鑒定
            2.2.2.4 、 α-半乳糖苷酶酶解對長臂猿紅細胞結(jié)構(gòu)功能的影響
            2.2.2.5 、 酶解對長臂猿紅細胞在體內(nèi)存活的影響
            2.2.2.6 、 酶解后長臂猿紅細胞的輸血實驗
    2.3 、 實驗結(jié)果
        2.3.1 、 獼猴實驗部分
            2.3.1.1 、 人抗-A、抗-B血清效價的測定結(jié)果
            2.3.1.2 、 實驗獼猴血型鑒定
            2.3.1.3 、 酶解后獼猴血型的鑒定
            2.3.1.4 、 酶解對獼猴紅細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響
            2.3.1.5 、 酶解紅細胞在受血獼猴體內(nèi)活存率
            2.3.1.6 、 獼猴輸血安全性評價
            2.3.1.7 、 回輸后α-半乳糖甘酶抗體檢測結(jié)果
        2.3.2 、 長臂猿實驗部分
            2.3.2.1 、 實驗長臂猿血型鑒定
            2.3.2.2 、 酶解后長臂猿血型的鑒定
            2.3.2.3 、 酶解對長臂猿紅細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響
            2.3.2.4 、 酶解紅細胞在受血猿體內(nèi)活存率
            2.3.2.5 、 輸血安全性評價
    2.4 、 討論
總結(jié)
參考文獻
致謝
發(fā)表論文

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本文編號：2827633