發(fā)布時間：2020-09-23 07:29

　　 p38 MAPK是一種應(yīng)激激活的絲／蘇氨酸蛋白激酶，屬于MAPK超家族；目前已發(fā)現(xiàn)p38 MAPK家族成員有p38(α)、p38 β、p38 γ、p38 δ，分子量約38～40kD。各個亞型之間的不同功能部分與它們在不同組織的表達，激活方式以及底物特異性相關(guān)，不同的p38能被細胞應(yīng)激(紫外線輻射、滲透性休克、熱休克、脂多糖、蛋白合成抑制劑)、某些細胞因子IL-1、TNF-α等激活。 細胞應(yīng)激或細胞表面受體與配體的結(jié)合介導(dǎo)p38的激活是一種由特定的激酶通過一種高度保守的三級激酶模式(MKKK／MKK/MAPK)而激活的過程。p38是在蘇氨酸(Thr)-甘氨酸(Gly)-酪氨酸(Tyr)活化基團中Thr和Tyr雙位點上被磷酸化而激活。能磷酸化激活p38的蛋白激酶有MKK3和MKK6。這兩種MKK都能被TAK1、ASK1、SPRK、PAK等激活。 p38被激活后將磷酸化一些特異性底物。目前已發(fā)現(xiàn)的底物有多種轉(zhuǎn)錄因子，如ATF2、CHOP10、MEF2C、Max；此外還包括一些蛋白激酶，如MAPKAPK 2和3、PRAK、MNK 1和2等。 由于p38能磷酸化許多不同的底物，因而有理由認為p38具有許多不同的生物學(xué)功能。p38 MAPK的激活涉及到細胞生長、細胞周期、細胞凋亡等過程。同時，也涉及到炎癥和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控、細胞骨架重組等，甚至在某些疾病過程都有重要作用，如在心肌肥大、缺血／再灌注損傷、神經(jīng)元病理、感染性疾病、創(chuàng)傷愈合和組織重塑中均有p38參與。 PRAK是一個受p38調(diào)控的絲氨酸／蘇氨酸激酶，由471個氨基酸組成，分子量約54kD；在細胞應(yīng)激和致炎因子的刺激下，細胞中的PRAK能被p38磷酸化激活，被激活的PRAK轉(zhuǎn)而磷酸化激活小分子量熱休克蛋白27(sHSP27)，從而介導(dǎo)細胞骨架重構(gòu)，參與細胞應(yīng)激反應(yīng)。但對其具體機制卻知之甚少。另外，內(nèi)源性PRAK主要定位于胞質(zhì)中；而外源性表達的PRAK則主要位于核中。序列分析表明，PRAK同時含有一個 核輸出信號(NES)和一個核定位信號(NLS)，而這兩者對于PRAK的 穿梭而言是必不可少的。在受到刺激后，由于PRAK入核減少而出核增 加，導(dǎo)致核中的PRAK減少。PRAK的入核不依賴于p38的激活，但出 核則依賴于p38對其的磷酸化。因而，PRAK的亞細胞分布由多種因素 決定，而且PRAK在胞質(zhì)與胞核之間的穿梭到底介導(dǎo)哪些細胞功能也不 清楚。 從以上可以看出，p38MApK信號通路具有廣泛的和復(fù)雜的生物學(xué) 作用，但這也僅僅是該通路的部分功能，仍有許多功能有待揭示。為了 進一步了解p38 MAPK及其下游激酶PRAK的重要作用，我們利用一種 新的篩選技術(shù)T7噬菌體篩選系統(tǒng)篩選了與p38及PRAK相結(jié)合的蛋白。 噬菌體展示技術(shù)是尋找與靶蛋白(已知蛋白)有結(jié)合關(guān)系的多膚或 蛋白的有效方法。該方法的原理是以靶蛋白為誘餌，通過結(jié)合一洗脫一 擴增3個步驟，篩選噬菌體cDNA文庫，獲得與靶蛋白結(jié)合的多膚或蛋 白。T7噬菌體篩選系統(tǒng)具有簡單、快速地篩選到相當長度的多膚或蛋白 質(zhì)的優(yōu)點，為研究蛋白質(zhì)相互作用提供一個強有力的手段。 經(jīng)過篩選，我們共得到46個與p38結(jié)合的預(yù)選蛋白，13個與PRAK 結(jié)合的預(yù)選蛋白，非常有趣的是我們用這兩個蛋白均篩選得到一個相同 的蛋白HPeZ(h切叮an homolog of polyeombZ，HPCZ)。HpCZ是哺乳類 動物Polycombgro叩(PcG)家族成員。Polycomb家族在果蠅中研究較 多，具有抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用，而且經(jīng)常和與其相拮抗的Trithorax grouP (TrxC)家族成員一起，通過多種機制如核昔酸修飾、染色質(zhì)重構(gòu)及與 轉(zhuǎn)錄因子相互作用來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄�，F(xiàn)有實驗證實，哺乳類的幾個PcG 成員在胚胎的發(fā)育、細胞增殖、細胞周期調(diào)控以及腫瘤的發(fā)生中具有重 要作用。 我們亞克隆了兩個HPCZ的真核表達載體:pEGFP一cZ舊PcZ與 peDNA3一fl眼肛peZ，并將pEJP一CZ艦pCZ轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞 (H EK293)中，發(fā)現(xiàn)增強型綠色熒光(E GFP)主要存在于核內(nèi)，并且在核 的某些區(qū)域有較強EGFP的不連續(xù)聚集，呈顆粒狀分布;隨后我們探討 了HPCZ對應(yīng)激刺激的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)過表達的EGFP舊PCZ僅對山梨 醇(sorbitol)引起的高滲有反應(yīng)，由刺激前的聚集于核內(nèi)發(fā)展為刺激后 的彌散分布于整個細胞，而對LPS、NaAs02、HZo:刺激并未出現(xiàn)這種反 一4一 應(yīng);我們將pcDNA3一flag肘PCZ轉(zhuǎn)染HE心93后，給予50比itol刺激，利 用核質(zhì)分離和westem blot技術(shù)得到進一步證實;雖然，我們在篩選過程 中用p38和PRAK同時得到HPCZ，但研究發(fā)現(xiàn)p38特異性抑制劑 SB203580不能阻止sothitol引起HPCZ的出核效應(yīng)。 綜上所述，我們利用T7噬菌體展示篩選系統(tǒng)，以P38M”K和PRAK 為靶蛋白，篩選了人肝和人肺文庫，得到多個可能與二者相互作用的蛋 白，為下一步深入研究p38信號通路的復(fù)雜功能和調(diào)節(jié)機制提供新的切 入點;同時將篩選到的一個可能與P38 MAPK和PRAK均有結(jié)合的蛋白 HPCZ，亞克隆到兩個真核表達載體上，并對其在真核細胞中的表達定位 及與應(yīng)激刺激關(guān)系作了初步探討。
【學(xué)位單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R341

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2825029