人骨形成蛋白(hBMP)家族中目前已發(fā)現(xiàn)的共有13種hBMP分子，除hBMP-1外，都屬于TGF-p超家族成員。最初由于它們具有誘骨活性而被發(fā)現(xiàn)和重視，新的研究表明，人骨形成蛋白不僅在治療骨缺損和骨不連方面顯示出極大的應(yīng)用價值和潛力，而且在胚胎發(fā)生、神經(jīng)細(xì)胞分化、造血組織發(fā)育、精子發(fā)生、胎盤形成，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等諸多方面都有著重要的作用，故一度成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。人們先后利用基因工程的方法在大腸桿菌以及COS、CHO、昆蟲等真核細(xì)胞中表達(dá)該基因，但截止目前國內(nèi)外尚未見到有用乳腺細(xì)胞表達(dá)hBMP的報道。對于功能基因hBMP-3的獲取，國內(nèi)外學(xué)者大多采用從人cDNA文庫中篩選的方法。利用篩庫的方法獲得基因有一定的優(yōu)點，但這種方法也存在著工作量大，前期投入高等缺點。鑒于此，本研究擬通過RT-PCR的方法克隆該基因，為利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生產(chǎn)人骨形成蛋白創(chuàng)造條件。 本實驗以人骨纖維肉瘤為實驗材料，采用RT-PCR技術(shù)對人骨形成蛋白3基因的部分cDNA進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆、序列測定和分析。實驗首先用TRIZOL試劑成功地從液氮中保存的人骨纖維肉瘤組織中分離得到總RNA。將總RNA反轉(zhuǎn)錄成為CDNA。以CDNA為模板，根據(jù)人骨形成蛋白3基因的cDNA序列設(shè)計引物(正鏈引物：5′-acatcgctaaccaagtctga-3′，20-nt；負(fù)鏈引物：5′-gagcaataataggcatcaaag-3′21-nt)，擴(kuò)增出一條長度約為850bp的特異片段。PCR擴(kuò)增條件為：94°C變性2min，然后以94℃變性30sec，52.5℃退火30sec，72℃延伸1.5min為1個循環(huán)，循環(huán)35次，最后于72℃再延伸lOmin。使用DNA膠回收試劑盒回收和純化該片段。將回收片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5Q，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，HindⅢ酶切和PCR鑒定后測序。結(jié)果顯示所得到的片段大小為845bp，與Genebank中公布的hBMP-3基因相應(yīng)片段的序列同源性為100％，完全吻合。根據(jù)845個核苷酸序列推導(dǎo)出相應(yīng)的280個氨基酸的序列。 以上實驗結(jié)果證明：我們已經(jīng)成功地擴(kuò)增、克隆了人骨形成蛋白3(hBMP-3)基因cDNA的大部分序列，為開展利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生產(chǎn)人骨形成蛋白創(chuàng)造了條件。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：Q785

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 華松;山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離與培養(yǎng)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

本文編號：2825277