前言 1型糖尿病是由于胰島細(xì)胞自身免疫損傷導(dǎo)致的單一蛋白質(zhì)胰島素絕對(duì)缺乏的一種代謝障礙性疾病，從而成為基因治療的適應(yīng)癥。但是無序的胰島素基因分泌不能使血糖保持在穩(wěn)定的生理范圍內(nèi)，并產(chǎn)生極大的低血糖的危險(xiǎn)。通過胰島素生長因子結(jié)合蛋白1(IGFBP-1)插入到從鼠的肝臟中丙酮酸激酶(rLPK)的基因中提取的葡萄糖反應(yīng)元件(GLRE)聚合成三倍體(GLRE)_3的下游，我們構(gòu)建了一個(gè)胰島素基因調(diào)控系統(tǒng)，分別受胰島素抑制、葡萄糖激活，從而為構(gòu)建可調(diào)控的胰島素表達(dá)載體奠定基礎(chǔ)。 本試驗(yàn)的目的是 1：掌握從組織中提取DNA及PCR擴(kuò)增目的DNA技術(shù)。 2：掌握基因重組技術(shù)及鑒定方法。 3：構(gòu)建重組的含胰島素基因調(diào)控系統(tǒng)的載體，為糖尿病基因治療的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 材料與方法 1 用飽和氯化鈉法從肝臟(SD大鼠，雄性，四周齡)中提取基因組DNA。 2 用PCR方法從基因組DNA中擴(kuò)增IGFBP-1啟動(dòng)子，瓊脂糖電泳回收后標(biāo)記為P_0。 3 三倍體基因pUC118(GLRE)_3的測序結(jié)果正確，購于TaKaRa公司。 4 攜胰島素調(diào)控基因系統(tǒng)pUC118(GLRE)_3-IGFBP-1的載體構(gòu)建： 4．1 Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ雙酶切PCR產(chǎn)物P_0、載體pUC118(GLRE)_3過夜。 4．2 純化連接，熱轉(zhuǎn)化至JM109。 4．3 篩選出pUC118(GLRE)_3-IGFBP-1。 5 pUC118(GLRE)_3-IGFBP-1重組體的鑒定： 5．1 Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ酶切鑒定。 5 .2 PCR鑒定重組體。 5.3測序。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 l從肝組織中調(diào)取IGFBP一1啟動(dòng)子: 1 .1從肝臟中提取基因組DNA后，取1過電泳，結(jié)果見圖1。 1 .2從基因組DNA中PCR擴(kuò)增IGFBP一1啟動(dòng)子，PCR產(chǎn)物全部上樣回 收后，取1過電泳，得到420bp目的DNA，與曉nebank X67493的IGFBP一1啟 動(dòng)子基因大小相符，見圖2。 2攜胰島素調(diào)控基因的重組體構(gòu)建: 2.1雙酶切P0及p UClls(GL舊衛(wèi))3，回收取lul電泳，見圖3、4。 2.2轉(zhuǎn)化菌平板培養(yǎng)PCR篩菌，取sul PCR產(chǎn)物電泳，以三倍體(GL RE)3為參照，與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較，可見約720bp的片段，為三倍體GU伍與 IGFBP一1啟動(dòng)子堿基之和，見圖5。 2 .3用分離純化試劑盒提取質(zhì)粒后，取lul電泳，結(jié)果見圖6。 3.puc118(Gll伍)，一IGFBP一1重組體的鑒定: 3.1雙酶酶切重組體后，將酶切產(chǎn)物電泳，得到42Obp、3.3kb基因片 段，結(jié)果見圖7o 3 .2重組體PcR擴(kuò)增后電泳，與標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，于720bp處出現(xiàn)清晰 條帶，結(jié)果見圖8。 3.3重組體測序結(jié)果完全正確，見測序圖。 討論 1型糖尿病應(yīng)用胰島素基因治療要求胰島素的分泌要與生物的代謝要 求相適應(yīng)，為達(dá)到這一目的，我們構(gòu)建了一個(gè)胰島素調(diào)控基因系統(tǒng)。這一基 因調(diào)控系統(tǒng)是通過將胰島素敏感的，肝特異性的，鼠胰島素樣生長因子結(jié)合 蛋白·1(IGFBP一l)啟動(dòng)子插人到從鼠肝臟提取的丙酮酸激酶(d尸K)基因啟 動(dòng)子—葡萄糖反應(yīng)元件(GLRE)三倍體聚合后(GLf比3)基因的下游獲得 的。該基因調(diào)控系統(tǒng)在肝細(xì)胞中均有活性，并且其表達(dá)可被葡萄糖激活，被 胰島素抑制。經(jīng)過大量基礎(chǔ)研究，酶誘導(dǎo)已被證明為是增加基因轉(zhuǎn)錄的直 接結(jié)果。C七rman等認(rèn)定鼠胰島素基因的啟動(dòng)子與其葡萄糖反應(yīng)性有關(guān)的 葡萄糖反應(yīng)元件(Gll現(xiàn))定位為slbl，片段。Robe沈son等證明鼠胰島素樣 生長因子結(jié)合蛋白，1(IGFBP一l)啟動(dòng)子約420bp，主要受胰島素的調(diào)控。 本室通過分子生物學(xué)的基因點(diǎn)突變技術(shù)，使人胰島素原基因的B一C鏈 與C一A鏈連接處的二元堿變成四元堿，從而可被非p細(xì)胞內(nèi)普遍存在的 儷n酶所識(shí)別和剪切，合成成熟的胰島素分泌到細(xì)胞外，參與糖尿病患者 體內(nèi)糖代謝的調(diào)節(jié)。并已通過轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液證實(shí)有較高 濃度的成熟胰島素分泌。但是無序的胰島素分泌不能使血糖保持在穩(wěn)定的 生理范圍內(nèi)，并產(chǎn)生極大的低血糖的危險(xiǎn)，無法應(yīng)用于動(dòng)物模型及臨床。為 了應(yīng)用基因治療1型糖尿病，必須要有胰島素分泌的完善調(diào)控。 我們的目的是從鼠肝臟中提取IGFBP-1啟動(dòng)子，將單倍體GU壓亞克 隆成三倍體Gll比，重組構(gòu)建成完整的胰島素基因調(diào)控系統(tǒng)。后繼試驗(yàn)將 連接調(diào)控系統(tǒng)的胰島素基因完整的裝人逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染肝細(xì)胞，以驗(yàn)證胰 島素的可調(diào)控性。為確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，我們將IGFBP一1和Cll比基 因片段，以及突變的人胰島素原(飾INs)分別作限制酶圖譜分析，并與逆轉(zhuǎn) 錄病毒(pLxSN)相比較，選出可利用的酶切位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選取pUClls載 體作為連接GLRE3、IGFBp一1克隆載體。 叫Cll8載體的特點(diǎn)是多克隆位點(diǎn)較多，不僅能滿足本實(shí)驗(yàn)的要求，還 保證隨后克隆MpINS仍有足夠的酶切位點(diǎn)。 我們獲得了亞克隆到pUclls載體Sacl位點(diǎn)上的三倍體(Gll壓)3，并 在擴(kuò)增IGFBP一1的PcR引物上設(shè)計(jì)了勒nl、Xbal兩個(gè)酶切位點(diǎn)，以保證 PCR產(chǎn)物隨后定向克隆到pUclls載體(Gll比)3下游。并利用重組體仍含 有勒nl、Xbal酶切位點(diǎn)做酶切鑒定，利用pUclls載體上的引物通過 PCR方法鑒定重組體，最后將重組體送往大連寶生物測序鑒定，證明成功 構(gòu)建出含胰島素抑制、葡萄糖激活調(diào)控系統(tǒng)的p
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 袁鳳山,劉兆U

本文編號(hào)：2824045