背景近年來發(fā)現(xiàn)一種新的受體家族—toll-like receptors(TLRs),可能是控制過度炎癥反應的閘門。TLRs(Toll-like receptors)屬于Ⅰ類跨膜受體,其胞外區(qū)有富含亮氨酸重復序列的結構域(Leucine-rich repeats domain,LRR domain),負責刺激信號識別,而胞內(nèi)則是稱為Toll/IL-1R(TIR)的結構域,與信號的傳導相關,TLRs屬于識別病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)的受體,廣泛分布于單核巨噬細胞系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞、樹突細胞、部分消化道上皮等,其配體包括內(nèi)毒素(LPS),肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)和脂蛋白等。TLRs的激活將敲響侵入機體微生物的喪鐘(toll the bell),它通過識別PAMPs而激活先天性免疫反應途徑,并誘導適應性免疫反應的發(fā)生。研究表明TLR4或TLR2的激活將引起一系列下游分子的活化,隨后激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor- kappa B, NF-κB),最終引起以TNF-α等為中心的前炎癥因子激活,導致多種炎癥因子的瀑鏈式釋放而產(chǎn)生生物學效應。因此研究對TLRs的阻斷效應可幫助我們尋求一個從源頭控制過度炎癥反應的扳機點,從而達到有效調(diào)控機體過度炎癥反應的目的。 目的構建針對Toll-like receptor 4 (TLR4) mRNA的發(fā)夾結構RNA(small haparin RNA,shRNA)真核表達載體pEGFP-siRNA/TLR4,檢測該shRNA誘導的RNAi (RNA interference)對內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide, LPS)刺激RAW264.7細胞炎癥因子分泌的抑制作用,并探討其對炎癥反應的調(diào)控機制。 方法以攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位點的質(zhì)粒pEGFP-H1/siRNA為基礎,運用網(wǎng)絡工具設計針對TLR4 mRNA的寡核苷酸片段,克隆入pEGFP-H1/siRNA,構建表達EGFP及TLR4-shRNA的真核表達質(zhì)粒pEGFP-H1/TLR4,運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術將pEGFP-H1/TLR4轉(zhuǎn)染至小鼠巨噬細胞系RAW264.7,轉(zhuǎn)染24小時后予新霉素(G418)篩選獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,以熒光相差顯微鏡觀察細胞系中熒光蛋白的表達強度,再運用LPS刺激轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞,采用熒光定量PCR檢測其TLR2mRNA的表達,Western blot檢測下游關鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達,并以ELISA法檢測細胞系分泌炎癥因子的水平變化。 結果質(zhì)粒pEGFP-H1/siRNA及pEGFP-H1/TLR4分別用BbsⅠ和MluⅠ酶切電泳后,前者出現(xiàn)4.9kb和340bp的的條帶,后者出現(xiàn)5.0kb和220bp的條帶,與實驗設計的質(zhì)粒長度一致,且測序證實克隆序列正確。運用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將pEGFP-H1/TLR4轉(zhuǎn)染至RAW264.7細胞后,發(fā)現(xiàn)增強型熒光蛋白的表達率約為(45.25±9.23)%。獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞,運用LPS對其刺激后,其TLR2mRNA的的表達明顯低于未轉(zhuǎn)染組細胞,NF-κBp65表達下調(diào),且伴有TNF-α水平的分泌下降。 結論針對TLR4 mRNA的shRNA可能通過RNAi機制對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子的分泌有明顯的抑制作用;能降低LPS刺激下的RAW264.7細胞TLR2的表達,NF-κBp65表達下調(diào),并伴有TNF-α分泌的下降。TLR4可能通過某種機制調(diào)節(jié)TLR2的表達。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2006
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

圖1 APC上的TLR調(diào)節(jié)Th細胞的分化 圖2 LPS－TLR途徑近年來，RNA干擾技術成為研究熱點，預測未來10年間最有可能出重大成果的領域之一。RNAi是細胞本身固有的對抗外源基因及其侵害的一種自我保護象，是雙鏈RNA (double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平關閉相應序列基因的表達使其沉默的過程。它是指當細胞中導入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)。外源dsRNA進入細胞后產(chǎn)生的小分子干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）的反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復合物(RNAinduced silencing complex， RISC)，RISC具有結合和切割mRNA的作用而介導RNA干擾的過程[6]。（圖3）

圖1 APC上的TLR調(diào)節(jié)Th細胞的分化 圖2 LPS－TLR途徑近年來，RNA干擾技術成為研究熱點，預測未來10年間最有可能出重大成果的領域之一。RNAi是細胞本身固有的對抗外源基因及其侵害的一種自我保護象，是雙鏈RNA (double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平關閉相應序列基因的表達使其沉默的過程。它是指當細胞中導入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)。外源dsRNA進入細胞后產(chǎn)生的小分子干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）的反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復合物(RNAinduced silencing complex， RISC)，RISC具有結合和切割mRNA的作用而介導RNA干擾的過程[6]。（圖3）

RNA作用機制示意圖

【參考文獻】

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本文編號：2823186