背景近年來發(fā)現(xiàn)一種新的受體家族—toll-like receptors(TLRs),可能是控制過度炎癥反應(yīng)的閘門。TLRs(Toll-like receptors)屬于Ⅰ類跨膜受體,其胞外區(qū)有富含亮氨酸重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)域(Leucine-rich repeats domain,LRR domain),負(fù)責(zé)刺激信號(hào)識(shí)別,而胞內(nèi)則是稱為Toll/IL-1R(TIR)的結(jié)構(gòu)域,與信號(hào)的傳導(dǎo)相關(guān),TLRs屬于識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)的受體,廣泛分布于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞、樹突細(xì)胞、部分消化道上皮等,其配體包括內(nèi)毒素(LPS),肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)和脂蛋白等。TLRs的激活將敲響侵入機(jī)體微生物的喪鐘(toll the bell),它通過識(shí)別PAMPs而激活先天性免疫反應(yīng)途徑,并誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的發(fā)生。研究表明TLR4或TLR2的激活將引起一系列下游分子的活化,隨后激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor- kappa B, NF-κB),最終引起以TNF-α等為中心的前炎癥因子激活,導(dǎo)致多種炎癥因子的瀑鏈?zhǔn)结尫哦a(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。因此研究對(duì)TLRs的阻斷效應(yīng)可幫助我們尋求一個(gè)從源頭控制過度炎癥反應(yīng)的扳機(jī)點(diǎn),從而達(dá)到有效調(diào)控機(jī)體過度炎癥反應(yīng)的目的。 目的構(gòu)建針對(duì)Toll-like receptor 4 (TLR4) mRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(small haparin RNA,shRNA)真核表達(dá)載體pEGFP-siRNA/TLR4,檢測(cè)該shRNA誘導(dǎo)的RNAi (RNA interference)對(duì)內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide, LPS)刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌的抑制作用,并探討其對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。 方法以攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒pEGFP-H1/siRNA為基礎(chǔ),運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)工具設(shè)計(jì)針對(duì)TLR4 mRNA的寡核苷酸片段,克隆入pEGFP-H1/siRNA,構(gòu)建表達(dá)EGFP及TLR4-shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-H1/TLR4,運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEGFP-H1/TLR4轉(zhuǎn)染至小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后予新霉素(G418)篩選獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,以熒光相差顯微鏡觀察細(xì)胞系中熒光蛋白的表達(dá)強(qiáng)度,再運(yùn)用LPS刺激轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞,采用熒光定量PCR檢測(cè)其TLR2mRNA的表達(dá),Western blot檢測(cè)下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá),并以ELISA法檢測(cè)細(xì)胞系分泌炎癥因子的水平變化。 結(jié)果質(zhì)粒pEGFP-H1/siRNA及pEGFP-H1/TLR4分別用BbsⅠ和MluⅠ酶切電泳后,前者出現(xiàn)4.9kb和340bp的的條帶,后者出現(xiàn)5.0kb和220bp的條帶,與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的質(zhì)粒長(zhǎng)度一致,且測(cè)序證實(shí)克隆序列正確。運(yùn)用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將pEGFP-H1/TLR4轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)型熒光蛋白的表達(dá)率約為(45.25±9.23)%。獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞,運(yùn)用LPS對(duì)其刺激后,其TLR2mRNA的的表達(dá)明顯低于未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞,NF-κBp65表達(dá)下調(diào),且伴有TNF-α水平的分泌下降。 結(jié)論針對(duì)TLR4 mRNA的shRNA可能通過RNAi機(jī)制對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子的分泌有明顯的抑制作用;能降低LPS刺激下的RAW264.7細(xì)胞TLR2的表達(dá),NF-κBp65表達(dá)下調(diào),并伴有TNF-α分泌的下降。TLR4可能通過某種機(jī)制調(diào)節(jié)TLR2的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2006
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

圖1 APC上的TLR調(diào)節(jié)Th細(xì)胞的分化 圖2 LPS－TLR途徑近年來，RNA干擾技術(shù)成為研究熱點(diǎn)，預(yù)測(cè)未來10年間最有可能出重大成果的領(lǐng)域之一。RNAi是細(xì)胞本身固有的對(duì)抗外源基因及其侵害的一種自我保護(hù)象，是雙鏈RNA (double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)使其沉默的過程。它是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)。外源dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后產(chǎn)生的小分子干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）的反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復(fù)合物(RNAinduced silencing complex， RISC)，RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用而介導(dǎo)RNA干擾的過程[6]。（圖3）

圖1 APC上的TLR調(diào)節(jié)Th細(xì)胞的分化 圖2 LPS－TLR途徑近年來，RNA干擾技術(shù)成為研究熱點(diǎn)，預(yù)測(cè)未來10年間最有可能出重大成果的領(lǐng)域之一。RNAi是細(xì)胞本身固有的對(duì)抗外源基因及其侵害的一種自我保護(hù)象，是雙鏈RNA (double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)使其沉默的過程。它是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)。外源dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后產(chǎn)生的小分子干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）的反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復(fù)合物(RNAinduced silencing complex， RISC)，RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用而介導(dǎo)RNA干擾的過程[6]。（圖3）

RNA作用機(jī)制示意圖

【參考文獻(xiàn)】

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1 馬鵬鵬,薛社普,韓代書;RNA干擾技術(shù)的原理與應(yīng)用[J];中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2003年02期

2 李泉,鄒最;炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與危急疾患[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊(cè);2002年02期

3 王繼文;RNA干擾技術(shù)及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));2003年03期

4 李力,張令強(qiáng),賀福初;RNA干擾應(yīng)用新進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2004年04期

5 蔣建新 ,朱佩芳 ,王正國(guó);內(nèi)毒素的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其在全身炎癥反應(yīng)綜合征中的作用[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2002年01期

6 邱海波,周韶霞,楊毅,黃英姿,鄭瑞強(qiáng);多器官功能障礙綜合征的死亡危險(xiǎn)因素分析及臨床對(duì)策[J];中華急診醫(yī)學(xué)雜志;2001年01期

7 陳華順,潘澤政;短干擾RNA靶向制備的原則和方法[J];實(shí)用臨床醫(yī)學(xué);2005年03期

8 黃宏;LPS受體及其信號(hào)傳導(dǎo)通路[J];免疫學(xué)雜志;2002年S1期

9 李峻,曹中偉,張順財(cái),周康;反義Toll樣受體4表達(dá)質(zhì)粒對(duì)內(nèi)毒素刺激小鼠巨噬細(xì)胞的影響[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年03期

10 孫劍;RNA干擾與技術(shù)[J];生物學(xué)雜志;2003年06期

本文編號(hào)：2823186