目的：分別構建攜有hGM-CSF、hIL4和hTNFα基因的AAV病毒，依次將這些基因導入外周血單個核細胞（PBMC），使后者持續(xù)、有效地分泌相應的細胞因子來體外誘導DC，彌補外源性細胞因子半衰期短價格昂貴的缺點，為最終探求一種更經濟、更方便的體外誘導獲取DC的方法奠定基礎。 方法：將攜帶有細胞因子的重組腺相關病毒載體（AAV/cytokine vector）與輔助質粒pHELPER共轉染到293細胞內包裝成重組腺相關病毒，測定病毒滴度。從健康人外周血中分離出單核細胞然后用病毒感染之，提取總RNA，以RT-PCR來檢測三種細胞因子在mRNA水平的表達。另外用同樣的方法從健康人外周血中分離出單核細胞，分成三組，一組用攜有細胞因子的重組腺相關病毒依次感染PBMC，通過自分泌和旁分泌相應的細胞因子持續(xù)作用來培養(yǎng)DC；一組直接用hGM-CSF、hIL4和hTNFα作用PBMC培養(yǎng)DC；另外一組只加入293細 WP=8 胞裂解液培養(yǎng)PBMC。將這三組培養(yǎng)數(shù)天的細胞，通過動態(tài)觀察、FACS分析檢測CD表面標記分子（CD14、CD40、CD83、CD86）的表達，以及用混合淋巴細胞反應等，進行鑒定比較重組AAV和外源性細胞因子的作用差異。 結果：（1）成功包裝病毒，并用非同位素（酶標）特異性探針斑點雜交法檢測病毒滴度為107-108eg/ml。（2）提取感染病毒的PBMC細胞的總RNA，以RT-PCR檢測到三種細胞因子mRNA的表達。（3）基因誘導培養(yǎng)的第十天可獲得典型的DC。經光學顯微鏡和電鏡觀察及流式細胞儀分析證實，所誘導的細胞具有典型的形態(tài)和結構特征，有較高的表面標記分子（CD14、CD40、CD83、CD86）的表達。(4)MLR的檢測表明，基因誘導的DC具有較強的刺激同種淋巴細胞反應的能力。 結論：（1）rAAV病毒能將外源基因導入真核細胞，有效和持續(xù)地表達，并減少了污染機會。（2）基因誘導可獲取典型的DC細胞。（3）rAAV誘導DC是一種經濟、方便和有效的體外誘導獲取DC的方法。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R373
【部分圖文】：

(由劉勇博士惠贈), 其結構如圖 2 所示Fig1-1 Conformation of AAV/cytokine vector圖 1-1 AAV/ cytokine vector 質粒結構示意圖Nco BamHHpaEcoRMspAAV/Cytokine/NeoTRTRAmpEcoRPolyASph

Fig2-3 Kinetics of CD expression rate of DC induced by rAAV圖 2-3 rAAV 誘導的 DC 表面 CD 分子表達率的 FACS動態(tài)分析注 293-lysate 7th day 為加 293 細胞裂解液培養(yǎng)第七天的細胞

Fig2-7 Mononuclear cell from peripheral blood圖 2-7 剛分離出來的外周血單個核細胞optical microscope 100 optical microscope 400光鏡 100 光鏡 400Fig2-8 At 2nd day (delivery of GM-CSF gene into cell after 24h by rAAV)圖 2-8 基因誘導培養(yǎng)第二天(AAV/GM-CSF 導入細胞 24 小時)

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 范萍,武正炎,王水,查小明,甄林林;人外周血中樹突狀細胞的誘導、培養(yǎng)及其表面標記的初步研究[J];南京醫(yī)科大學學報;2002年01期

本文編號：2822351