目的：分別構(gòu)建攜有hGM-CSF、hIL4和hTNFα基因的AAV病毒，依次將這些基因?qū)胪庵苎獑蝹�核細(xì)胞（PBMC），使后者持續(xù)、有效地分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子來體外誘導(dǎo)DC，彌補(bǔ)外源性細(xì)胞因子半衰期短價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)，為最終探求一種更經(jīng)濟(jì)、更方便的體外誘導(dǎo)獲取DC的方法奠定基礎(chǔ)。 方法：將攜帶有細(xì)胞因子的重組腺相關(guān)病毒載體（AAV/cytokine vector）與輔助質(zhì)粒pHELPER共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞內(nèi)包裝成重組腺相關(guān)病毒，測定病毒滴度。從健康人外周血中分離出單核細(xì)胞然后用病毒感染之，提取總RNA，以RT-PCR來檢測三種細(xì)胞因子在mRNA水平的表達(dá)。另外用同樣的方法從健康人外周血中分離出單核細(xì)胞，分成三組，一組用攜有細(xì)胞因子的重組腺相關(guān)病毒依次感染PBMC，通過自分泌和旁分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子持續(xù)作用來培養(yǎng)DC；一組直接用hGM-CSF、hIL4和hTNFα作用PBMC培養(yǎng)DC；另外一組只加入293細(xì) WP=8 胞裂解液培養(yǎng)PBMC。將這三組培養(yǎng)數(shù)天的細(xì)胞，通過動態(tài)觀察、FACS分析檢測CD表面標(biāo)記分子（CD14、CD40、CD83、CD86）的表達(dá)，以及用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等，進(jìn)行鑒定比較重組AAV和外源性細(xì)胞因子的作用差異。 結(jié)果：（1）成功包裝病毒，并用非同位素（酶標(biāo)）特異性探針斑點(diǎn)雜交法檢測病毒滴度為107-108eg/ml。（2）提取感染病毒的PBMC細(xì)胞的總RNA，以RT-PCR檢測到三種細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)。（3）基因誘導(dǎo)培養(yǎng)的第十天可獲得典型的DC。經(jīng)光學(xué)顯微鏡和電鏡觀察及流式細(xì)胞儀分析證實(shí)，所誘導(dǎo)的細(xì)胞具有典型的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征，有較高的表面標(biāo)記分子（CD14、CD40、CD83、CD86）的表達(dá)。(4)MLR的檢測表明，基因誘導(dǎo)的DC具有較強(qiáng)的刺激同種淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力。 結(jié)論：（1）rAAV病毒能將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞，有效和持續(xù)地表達(dá)，并減少了污染機(jī)會。（2）基因誘導(dǎo)可獲取典型的DC細(xì)胞。（3）rAAV誘導(dǎo)DC是一種經(jīng)濟(jì)、方便和有效的體外誘導(dǎo)獲取DC的方法。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R373
【部分圖文】：

(由劉勇博士惠贈), 其結(jié)構(gòu)如圖 2 所示Fig1-1 Conformation of AAV/cytokine vector圖 1-1 AAV/ cytokine vector 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖Nco BamHHpaEcoRMspAAV/Cytokine/NeoTRTRAmpEcoRPolyASph

Fig2-3 Kinetics of CD expression rate of DC induced by rAAV圖 2-3 rAAV 誘導(dǎo)的 DC 表面 CD 分子表達(dá)率的 FACS動態(tài)分析注 293-lysate 7th day 為加 293 細(xì)胞裂解液培養(yǎng)第七天的細(xì)胞

Fig2-7 Mononuclear cell from peripheral blood圖 2-7 剛分離出來的外周血單個核細(xì)胞optical microscope 100 optical microscope 400光鏡 100 光鏡 400Fig2-8 At 2nd day (delivery of GM-CSF gene into cell after 24h by rAAV)圖 2-8 基因誘導(dǎo)培養(yǎng)第二天(AAV/GM-CSF 導(dǎo)入細(xì)胞 24 小時)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 范萍,武正炎,王水,查小明,甄林林;人外周血中樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)、培養(yǎng)及其表面標(biāo)記的初步研究[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2002年01期

本文編號：2822351