人核糖核酸酶抑制因子(Human Ribonuclease Inhibitor, hRI)是分布在細(xì)胞漿中的一種酸性蛋白,分子量為50kDa。hRI是由15個(gè)亮氨酸重復(fù)序列(Leucine-rich repeat, LRR)組成的。它含有32個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基,這些半胱氨酸都是處于還原狀態(tài),這是其維持正常的生物學(xué)活性所必需的,這也決定了hRI只有在還原性的環(huán)境下如胞液中才能發(fā)揮其功能。hRI的三級(jí)結(jié)構(gòu)呈對(duì)稱(chēng)的馬蹄形結(jié)構(gòu)。hRI能抑制胰臟來(lái)源的RNAaseA活性,hRI與RNaseA緊密結(jié)合形成1:1的復(fù)合物。hRI也是血管生成因子(Angiogenin,Ang)的高效抑制劑。 人的RI基因定位于11號(hào)染色體(11p15.5)。 在癌癥患者中,染色體11p15.5部位常常有變異, 因而RI可能與細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化相關(guān)。眾所周知,新生血管形成是腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移所必需的。所以抑制腫瘤血管的生長(zhǎng),成為腫瘤治療的重要方法之一。血管生成因子在正常的或癌變的組織和細(xì)胞都有分布。血管生成因子作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,具有強(qiáng)烈的誘發(fā)血管生成活性。hRI由于其與血管生成因子的特殊作用,使之成為一種比較有潛力的腫瘤治療的藥物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已逐漸證實(shí),hRI具有抑制動(dòng)物體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)的作用。本實(shí)驗(yàn)室從人胎盤(pán)中和豬肝中提取的RI,給予荷瘤小鼠后可以抑制乳腺癌實(shí)體瘤Ca761,肉瘤S180,肝癌實(shí)體瘤H22的生長(zhǎng)。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)惡性腫瘤患者紅細(xì)胞中RI活性下降,瘤組織內(nèi)的基因表達(dá)下降。 WP=5 因?yàn)镽I在腫瘤治療中有較好的應(yīng)用前景,并且RI從組織中提取的產(chǎn)量較少,成本高,不適宜大批量生產(chǎn),所以本室一直研究其基因工程生產(chǎn)的方法。但是重組的RI在大腸桿菌中的表達(dá)后是以包含體的形式存在。包涵體是重組蛋白在菌體內(nèi)過(guò)表達(dá)后形成的聚集體,但是其所含的重組蛋白沒(méi)有生物學(xué)活性。這個(gè)問(wèn)題一直困擾著我們,使我們的工作停步不前。本文主要研究了包含體的復(fù)性及純化,為此作了以下的一些工作: 1.hRI在 E.coli中的表達(dá):用小量堿裂解法提取重組質(zhì)粒pET23b-ri 并用氯化鈣法轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)。將BL21(DE3)置于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增至A600=0.6后加入誘導(dǎo)劑IPTG,誘導(dǎo)hRI的表達(dá)。 2.包涵體的純化和溶解:超聲破碎細(xì)菌后,離心取沉淀,即包涵體。用含有去垢劑的緩沖液反復(fù)洗滌包涵體,以除去脂類(lèi)、膜蛋白、黏附在其上的蛋白質(zhì)。最后用含有8M的尿素和20mmol/Lβ-巰基乙醇的緩沖液將包涵體溶解。 3.包涵體復(fù)性:本文采用了三種復(fù)性方法,分別是稀釋法、凝膠過(guò)濾層析法、透析法。 1)稀釋法: 在稀釋過(guò)程中嘗試添加非離子型去垢劑TritonX-100來(lái)促進(jìn)hRI的復(fù)性。并考察了復(fù)性條件:TritonX-100的濃度、初始蛋白濃度、復(fù)性時(shí)間。 2)凝膠過(guò)濾層析法:采用Sephadex G-150層析柱,上樣蛋白濃度1mg/L左右,上樣量為0.4—0.8ml,流速為4—6ml/h。 3)透析法:線(xiàn)性的從初始的4mol/L,以0.3mol/h的速度降低透析液中的尿素濃度,5h后停止。保持此尿素濃度(大約2.5mol/L)透析12h。繼續(xù)線(xiàn)性的以0.3mol/h的速度降低透析液中的尿素濃度,7h后停止。 4.親和柱層析純化:使用的配基為RNaseA。用緩沖液平衡親和柱CNBr活化的Sepharose 4B,直至檢測(cè)基線(xiàn)平穩(wěn)。取復(fù)性后的樣品上樣。用緩沖液洗柱子,去除未結(jié)合的雜蛋白,直至基線(xiàn)穩(wěn)定。用洗脫緩沖液洗脫柱子, 收集目標(biāo)蛋白。 WP=6 本文成功的使包涵體復(fù)性。發(fā)現(xiàn)在稀釋中添加TritonX-100的濃度為0.05%,初始蛋白濃度為0.5mg/ml時(shí)復(fù)性效果比較好,相對(duì)復(fù)性率為12.3%;凝膠過(guò)濾層析法hRI相對(duì)復(fù)性率為10.7%;透析法hRI相對(duì)復(fù)性率為1%。復(fù)性后的蛋白質(zhì)經(jīng)RNaseA-Sepharose4B親和柱層析純化,純度達(dá)95%左右。這些為RI基因工程方法生產(chǎn)奠定一定的實(shí)踐基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類(lèi)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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4 鄧?yán)?胡小芳;盧明s

本文編號(hào)：2821627