骨髓中存在一定數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，能夠通過分化形成多種中胚層組織。由于MSCs具有吸附塑料表面的特性以及特異的表面標(biāo)志(高表達(dá)CD166、CD29、CD13、CD105，不表達(dá)CD34、CD45、HLADR)，因此可以從骨髓中分離出來并通過流式細(xì)胞技術(shù)加以鑒定。 研究證明MSCs可為骨、軟骨、肌腱、心肌等組織的修復(fù)和重建提供細(xì)胞來源，并且可以支持體內(nèi)造血、誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)抗原的低反應(yīng)性、降低異基因造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，但其免疫調(diào)控的機(jī)制尚不清楚。人骨髓中的MSCs含量極少，10~4-10~5個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞中僅含1個(gè)MSC，難以滿足組織工程和自體或異體移植的需要。因此，體外擴(kuò)增MSCs并研究其生物學(xué)特性尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用Percoll(1.073g／ml)密度梯度離心法分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞，將之接種于含10％FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基中，利用MSCs黏附于塑料表面的特性，獲得純化的MSCs。采用本方法細(xì)胞貼壁快，易純化，P3代細(xì)胞的均一性達(dá)到98％以上，原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)顯示，在體外培養(yǎng)條件下人骨髓MSCs有活躍的增殖能力，來源于骨髓5×10~6個(gè)單個(gè)核細(xì)胞(Mononuclear cell，MNC)的MSCs，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增P0、P5、P10代細(xì)胞數(shù)分別為10~6、10~8、10~(10)個(gè)，原代細(xì)胞潛伏期長，P10代以后的細(xì)胞生長速度變緩慢，出現(xiàn)衰老征象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床應(yīng)用MSCs提供了參考依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)同時(shí)定時(shí)、定量研究了MSCs對(duì)異基因T淋巴細(xì)胞表型的影響，以經(jīng)CO~(60)照射后的不同數(shù)量的MSC作為基底層細(xì)胞，接種體外分離純化的相同數(shù)量的異體T淋巴細(xì)胞，分別于0小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)、7天后用流式細(xì)胞技術(shù)測定各組T細(xì)胞表型的變化并計(jì)數(shù)各組T細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，當(dāng)T細(xì)胞數(shù)與MSC數(shù) 4 中文摘要一 比例為25:1(A組)、50:1(B組)時(shí)，CD4‘CD25‘細(xì)胞與對(duì)照組相比均明顯增 加(A組P=0.0023，B組P=0.0031)，CDS‘細(xì)胞明顯增多(A組P=0.0106，B組 P=0 .0148)，兩者均隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長而表達(dá)量逐漸增加，A組和B組之間 無明顯差別(P=0.2350)，實(shí)驗(yàn)組(A組和B組)與對(duì)照組相比，CD3+、CD4‘、 CD25+細(xì)胞無明顯差別;當(dāng)T細(xì)胞數(shù)與MSC數(shù)比例為100:1(C組)時(shí)，與對(duì)照 組相比，CD4表達(dá)略上調(diào)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD3‘、CDS‘、CD25‘、CD4‘CD25‘細(xì)胞 無明顯差別。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，與MSC共孵育組和單獨(dú)T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)組中T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量均呈下降趨勢，在第7天時(shí)T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)減少約 21.5%，與MSC共孵育組T淋巴細(xì)胞數(shù):A組減少65.00rk以上，B組減少60.00k，C 組減少12.5%。以上結(jié)果提示，MSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)加入的MSCS達(dá) 到一定的數(shù)量時(shí)(T細(xì)胞:MSC毛50:l)可以引起T淋巴細(xì)胞的表型發(fā)生改變， 表現(xiàn)為CD4℃D25十細(xì)胞和CDS+細(xì)胞明顯增多，并且抑制T淋巴細(xì)胞的增殖;而當(dāng)加 入的MSCS小于一定的數(shù)量時(shí)(T細(xì)胞:MSC〕100:1)，T淋巴細(xì)胞的表型無明 顯改變，并且刺激T淋巴細(xì)胞增殖。表明MSC的負(fù)調(diào)控機(jī)制可能與誘導(dǎo)CD4℃D25+ 免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及CDS+T細(xì)胞增多有關(guān)，同時(shí)也表明MSC對(duì)T淋巴細(xì)胞的作 用與MSC的數(shù)量有關(guān)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為防治異基因造血干細(xì)胞移植中GVHD和VGHR的發(fā)生、誘導(dǎo)免疫耐 受提出了一條新的思路，為臨床異基因造血干細(xì)胞移植時(shí)輸注MSCS預(yù)防GVHD的 MSCS輸注數(shù)量提供了參考依據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

第5天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第9天細(xì)胞數(shù)量增加了約10倍，平均13一14天細(xì)胞達(dá)90%融合，這時(shí)的細(xì)胞排列有一定的方向性，呈旋渦樣生長，細(xì)胞鋪滿了瓶底(圖2)，每瓶接近900/0融合的MSCS經(jīng)胰酶消化可獲得(1一2)x106個(gè)細(xì)胞，平均8一9天傳代1次。消化傳代的細(xì)胞于24小時(shí)內(nèi)完全貼壁，形態(tài)與原代細(xì)胞相似。體外擴(kuò)增至第3代、5代、10代時(shí)細(xì)胞數(shù)量分別為:2.35土1.08x107、2.78士1.34又10習(xí)、1.32士0.76xl0，。。MSCS傳至第10代以后，細(xì)胞胞體增大，細(xì)胞質(zhì)疏松，可見空泡，并可見折光基質(zhì)產(chǎn)生，細(xì)胞增殖變緩慢。圖1原代MSC培養(yǎng)72小時(shí)后出現(xiàn)的紡錘狀細(xì)胞(xZOO)圖2原代MSC連續(xù)培養(yǎng)兩周細(xì)胞達(dá)90%以上融合后的?

MSC的分離純化及形態(tài)學(xué)觀察剛接種的原代MSCS細(xì)胞呈圓形，大小不一，原代培養(yǎng)的MSC通常在培養(yǎng)72小時(shí)左右出現(xiàn)分散存在的貼壁的細(xì)胞克隆，細(xì)胞形態(tài)均一，呈紡錘形(圖1)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果巴細(xì)胞的生長情況SCs與外周血T淋巴細(xì)胞共孵育7天后，顯微鏡下觀察可見共孵育數(shù)量較T細(xì)胞單獨(dú)孵育組明顯減少(圖3.1、3.2)，T細(xì)胞單獨(dú)孵育后較培養(yǎng)前細(xì)胞數(shù)量有所減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T細(xì)胞的生長曲由生長曲線可見隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，與MSC共孵育組和單獨(dú)T淋巴T淋巴細(xì)胞的數(shù)量均呈下降趨勢，在第7天時(shí)T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì).5%，與MSC共孵育組T淋巴細(xì)胞數(shù):MSCS為2x10V孔組(C組5%;MSCs為4xlo‘/孔組(B組)時(shí)減少60.0%;MSCs為8x104/孔減少65.0%。

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