【摘要】： 糖尿病是由于體內(nèi)胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的以高血糖和糖尿?yàn)樘卣鞯膬?nèi)分泌代謝疾病，現(xiàn)已成為僅次于心血管疾病和癌癥的第三大危害人類健康的疾病。其中Ⅱ型(NIDDM)占80％以上。 目前，已有多種類型的抗糖尿病藥物在臨床應(yīng)用，主要有胰島素、胰島素類似物、磺酰脲類、雙胍類、噻唑烷二酮(TZD)類等，但存在使用不方便、療效低或毒性大等問題。而抗糖尿病中藥的成分復(fù)雜，多為復(fù)方制劑，物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚，對申請專利帶來較多不便。因此，開發(fā)新作用機(jī)制或新結(jié)構(gòu)類型的高效低毒的抗糖尿病藥物已成為國際上新藥研發(fā)的重點(diǎn)。 本研究分別在細(xì)胞和分子水平上建立藥物篩選模型，對天然小分子化合物進(jìn)行降糖活性篩選，并進(jìn)一步在動物模型上證實(shí)其抗糖尿病藥理活性，以期待發(fā)現(xiàn)具有新作用機(jī)制或新結(jié)構(gòu)類型的抗糖尿病藥物：[1]在細(xì)胞水平上建立脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗模型，對230個天然小分子化合物進(jìn)行初步篩選。用體外激素誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞后，加入不同濃度的小分子化合物，設(shè)為50、5、0.5 mg·L~(-1)，以胰島素10 mg·L~(-1)為陽性對照，48 h后檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中葡萄糖濃度，考察不同化合物促脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗作用。結(jié)果顯示其中63個化合物有不同程度的促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗作用，其中第33、51、96、200、202、211、212、213號化合物在50 mg·L~(-1)及170號在5 mg·L~(-1)濃度時(shí)呈現(xiàn)較強(qiáng)的降糖活性；[2]建立基于PPARγ信號通路的藥物篩選模型。從初篩出的63個化合物中進(jìn)一步篩選具有PPARγ受體激活活性的小分子化合物。先利用報(bào)告基因檢測技術(shù)，構(gòu)建含有PPRE片段的報(bào)告基因質(zhì)粒，將該報(bào)告基因質(zhì)粒與表達(dá)PPARγ的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，設(shè)定10、1.0 mg·L~(-1)兩個化合物加藥濃度，以馬來酸羅格列酮為陽性對照，考察對PPARγ信號通路的激活活性。從中我們又進(jìn)一步篩選出7個化合物，其中，60號化合物在1 mg·L~(-1)濃度時(shí)測得報(bào)告基因表達(dá)率在2倍以上，與10μmg·L~(-1)馬來酸羅格列酮的結(jié)果無顯著性差異(p＞0.05)：(3)建立ALX致糖尿病小鼠模型，對最終篩出的7個化合物中的4個(51、60、192、203號)在動物體內(nèi)的降糖活性進(jìn)行檢驗(yàn)。給KM小鼠尾靜脈注射ALX造模，陽性對照品MET設(shè)為250 mg·Kg~(-1)·d~(-1)，51號化合物按12.5、25、50 mg·Kg~(-1)·d~(-1)劑量，60、192、203號化合物按25、50、100 mg·Kg~(1-)·d~(-1)劑量分別灌服給藥7 d，分別在給藥的4、7 d取尾靜脈血測血糖值，考察不同化合物在不同劑量下對糖尿病模型小鼠血糖的影響。結(jié)果顯示51號化合物以25 mg·Kg~(-1)·d~(-1)、60號化合物以100mg·Kg~(-1)·d~(-1)、203號化合物以100 mg·Kg~(-1)·d~(-1)劑量給小鼠灌服7d后，小鼠血糖與模型對照組比較明顯下降(p＜0.05)；192號化合物以各劑量給藥條件下，小鼠血糖與模型對照組比較變化不明顯(p＞0.05)。 通過本實(shí)驗(yàn)成功建立二個體外初篩模型和一個整體動物模型。脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗模型具有成本低、所需樣品量少、篩選效率高等特點(diǎn)，但模型的穩(wěn)定性和特異性存在一定缺陷；基于PPARγ信號通路的初篩模型，具有靶點(diǎn)單一、機(jī)制明確等特點(diǎn)，模型具較好的特異性和穩(wěn)定性；ALX誘導(dǎo)的小鼠糖尿病模型形成率高，死亡率低，模型穩(wěn)定性好；對230個化合物進(jìn)行篩選，得到63個具有不同程度促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗作用的化合物，其中，7個化合物對PPARγ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有激活活性，最終4個在糖尿病小鼠模型上進(jìn)行驗(yàn)證的個化合物中51號、60號和203號化合物具體內(nèi)抗糖尿病藥理活性，降糖效果同MET。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R-332
【圖文】：

2結(jié)果與分析2.1模型建立葡萄糖消耗模型的建立分化后蘇丹111染色結(jié)果細(xì)胞在誘導(dǎo)分化前，細(xì)胞呈梭形或多邊形的不規(guī)則狀化sd后，蘇丹m染色30而n，顯微鏡可見細(xì)胞內(nèi)聚集結(jié)果顯示，約800/0的3T3一Ll細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成脂肪

約800/0的3T3一Ll細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞1.小鼠3T3一Ll成纖維細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)不含脂肪顆粒(200x)di卯Cy如a作萬b功blasti‘therea比notfa川均p加t8恤燈加p腸靦a

圖3.胰島素促3T3一Ll脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗曲線her:.teofglueoseuPtakeof3T3一L1adiP0cytecelIstreatedwithdifferentc0ncentinsulin.ZPI叭R丫信號通路的藥物篩選模型的建立.1重組質(zhì)粒pTAL一PPREI/2一SEAP酶切鑒定酶切電泳結(jié)果顯示，篩選得到的陽性重組質(zhì)粒pTAL一PPREI一一ppREZ一SEAp分別在86bp和58bp處有一條亮帶(Fig.4)。.2重組質(zhì)粒的選擇相同的轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染pTK一PPRE一Luc報(bào)告基因質(zhì)粒的293T細(xì)胞表達(dá)率最高，當(dāng)馬來酸羅格列酮為10林mol.L一，濃度時(shí)，可達(dá)最高誘

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 姜斐;女貞子化學(xué)成分的提取分離鑒定及活性研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2010年

2 章蕾;PPARγ2激動劑篩選模型的建立及其在黑茶提取物調(diào)節(jié)血糖功能評價(jià)中的應(yīng)用[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

本文編號：2802606