【摘要】：目的:1.通過(guò)葡萄糖聯(lián)合皮質(zhì)酮干預(yù)由NE、AS、BM組成的海馬區(qū)神經(jīng)血管單元,建立模擬DD環(huán)境下體外海馬區(qū)NVU模型,并從細(xì)胞形態(tài)、屏障功能、基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)、分泌功能多角度建立模型評(píng)價(jià)體系。2.以模擬DD環(huán)境下海馬區(qū)NVU體外模型為研究對(duì)象,給予中藥復(fù)方左歸降糖解郁方干預(yù),明確其對(duì)模擬DD環(huán)境下海馬區(qū)NVU體外模型的保護(hù)作用的機(jī)制,為DD的防治提供新思路。方法:1.模擬DD環(huán)境下海馬區(qū)NVU模型的建立。分離并純化的NE、AS、BM細(xì)胞建立NE+AS、AS+BM、NE+AS+BM三個(gè)正常對(duì)照組及NE+AS+GP、AS+BM+GP、NE+AS+BM+GP三個(gè)模型對(duì)照組。在本課題組前期工作基礎(chǔ)上改進(jìn)其實(shí)驗(yàn)方法,采用葡萄糖(150mmol/L)及皮質(zhì)酮(200μmol/L)干預(yù)18h,(1)細(xì)胞形態(tài)評(píng)價(jià):倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài);(2)屏障功能評(píng)價(jià):細(xì)胞電阻儀測(cè)跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值、4 h滲漏試驗(yàn);(3)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià):Western-blotting方法檢測(cè)BM結(jié)構(gòu)蛋白Occluding、AS縫隙連接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP蛋白的表達(dá);(4)分泌功能評(píng)價(jià):ELISA法檢測(cè)BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量、ELISA法檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT含量、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元的凋亡情況。2.左歸降糖解郁方對(duì)模擬DD環(huán)境下海馬區(qū)NVU模型的保護(hù)作用。采用方法1建立模擬DD環(huán)境下海馬區(qū)NVU模型,并隨機(jī)分為正常對(duì)照組、正常+空白血清組、模擬DD環(huán)境下海馬區(qū)NVU模型組(模型組)、模型+(二甲雙胍+氟西汀)含藥血清組、模型+左歸降糖解郁方含藥血清組5組。除正常對(duì)照組及正常+空白血清組外其它三組造模給藥18h后,(1)細(xì)胞形態(tài)評(píng)價(jià):倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài);(2)屏障功能評(píng)價(jià):細(xì)胞電阻儀測(cè)跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值、4 h滲漏試驗(yàn);(3)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià):Western-blotting方法檢測(cè)BM結(jié)構(gòu)蛋白Occluding、AS縫隙連接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP蛋白的表達(dá);(4)分泌功能評(píng)價(jià):ELISA法檢測(cè)BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量、ELISA法檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT含量、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元的凋亡情況。結(jié)果:1.與正常對(duì)照組比較,葡萄糖聯(lián)合及皮質(zhì)酮兩細(xì)胞或三細(xì)胞模型組培養(yǎng)體系中NE、AS、BM細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯變差;跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值顯著降低,4h滲漏試驗(yàn)液面差顯著增大(P0.05);AS縫隙連接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP和BM緊密連接蛋白o(hù)ccluding的表達(dá)明顯降低(P0.05);細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞上清液5-HT含量明顯降低(P0.05);BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量顯著降低(P0.05);海馬神經(jīng)元凋亡率升高(P0.05)。2.與正常對(duì)照組及正常血清比較,模型組各項(xiàng)指標(biāo)均出現(xiàn)明顯異常。與模型組比較,左歸降糖解郁方含藥血清組生長(zhǎng)狀態(tài)明顯變好;跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值顯著升高,4h滲漏試驗(yàn)液面差顯著減小(P0.05);AS縫隙連接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP和BM緊密連接蛋白o(hù)ccluding的表達(dá)明顯增加(P0.05)。BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量顯著升高(P0.05);細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞上清液5-HT含量明顯升高(P0.05);海馬神經(jīng)元凋亡率降低(P0.05)。結(jié)論:1.結(jié)合本課題組前期研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇葡萄糖(150 mmol/L)及皮質(zhì)酮(200μmol/L)進(jìn)行干預(yù);結(jié)合DD臨床特征及神經(jīng)血管單元生理作用,采用形態(tài)學(xué)、結(jié)構(gòu)、功能等多角度指標(biāo)建立一套模擬DD環(huán)境下海馬區(qū)NVU體外模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)。2.模擬DD環(huán)境下海馬區(qū)NVU體外模型其細(xì)胞形態(tài)、屏障功能、基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)、分泌功能的損傷,這可能是DD發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制。3.左歸降糖解郁方可改善海馬區(qū)NVU各組成細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)分泌紊亂,改善海馬區(qū)NVU屏障功能,提高海馬區(qū)NVU功能相關(guān)分泌蛋白LIF、TGF-β、GDNF、bFGF、ANG1表達(dá),升高海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率,對(duì)模擬DD環(huán)境下海馬區(qū)NVU體外模型有一定改善作用,值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。
【學(xué)位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R285.5;R-332
【圖文】：

圖 1.1 NE、AS、BM 三種細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)及鑒定（400×）A. NE 原代培養(yǎng) 5d B. NSE 熒光鑒定 C. AS 第二代培養(yǎng)D. GFAP 熒光鑒定 E. BM 第二代培養(yǎng) 5d F.CD31 熒光鑒定擬 DD 環(huán)境下海馬區(qū) NVU 的形態(tài)觀察相差顯微鏡下，對(duì)正常共培養(yǎng)海馬區(qū) NVU 及高糖聯(lián)合皮質(zhì)酮造模VU進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。模型（NE+AS+G&P）（AS+BM+G&P）（NVU+正常（NE+AS）（AS+BM）（NE+AS+BM）組比較，神經(jīng)元軸突斷裂，星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞體顆粒狀增多，折光率增多。模型組內(nèi)，（NVU+G&P）對(duì)照組與（NE+AS+G&P）（AS+BM+較，共培養(yǎng)早期海馬神經(jīng)元差異鏡下觀察無(wú)太大差異，共培養(yǎng)，海馬神經(jīng)元細(xì)胞碎片較少，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)豐富度較高，星形膠質(zhì)細(xì)胞

圖 1.2 模擬 DD 環(huán)境下海馬區(qū) NVU 模型中 NE 的生長(zhǎng)狀態(tài)（100×）A. NE+AS 組 B. NVU 組 C. NE+AS+G&P 組 D. NVU+G&P 組圖 1.3 模擬 DD 環(huán)境下海馬區(qū) NVU 模型中 AS 的生長(zhǎng)狀態(tài)（100×）

皮質(zhì)酮對(duì)海馬區(qū) NVU 形態(tài)有損傷作用。圖 1.2 模擬 DD 環(huán)境下海馬區(qū) NVU 模型中 NE 的生長(zhǎng)狀態(tài)（100×）A. NE+AS 組 B. NVU 組 C. NE+AS+G&P 組 D. NVU+G&P 組

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2802418