【摘要】：B淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stilmulator, BLyS)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族成員之一,其主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。BLyS對(duì)于B淋巴細(xì)胞的生長、分化、增殖和凋亡有著非常重要的影響。BLyS的過表達(dá)與多種人類自身性免疫疾病有關(guān),如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,重癥肌無力,系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。尤其是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生、發(fā)展等一系列過程都與BLyS有著極其密切的關(guān)系。因此阻斷BLyS信號(hào)通路成為治療這類疾病行之有效的思路和方法,而針對(duì)BLyS這一靶點(diǎn)開發(fā)出的單克隆抗體藥物貝利木單抗在SLE的治療上起到了非常好的效果。比起全長抗體,單鏈抗體(single-chain fragment variable, ScFv)有著其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)：既能特異性地結(jié)合抗原,又不與含有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合。由于其分子量只有全長抗體的1/6,更易于穿透組織到達(dá)靶部位。因此抗BLyS單鏈抗體在自身性免疫疾病上具有潛在的治療價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗體庫篩選抗體是近些年來發(fā)展起來的較為新穎的抗體庫篩選技術(shù)。其主要依托于哺乳動(dòng)物細(xì)胞,將抗體的篩選直接移植到真核表達(dá)體系上來,這樣就解決了原核表達(dá)系統(tǒng)不具備蛋白翻譯后修飾的難題,使得表達(dá)的蛋白最接近天然的人源抗體。在本課題中,我們主要利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型人源ScFv抗體庫來篩選全新的、具有較高親和力的抗BLyS單鏈抗體,構(gòu)建、表達(dá)抗BLyS單鏈抗體并對(duì)其活性進(jìn)行初步的鑒定。第一部分利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型人源ScFv抗體庫篩選抗BLyS ScFv本部分的研究目的主要是利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型人源ScFv抗體庫篩選抗BLyS ScFv。首先將抗體庫轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,使庫中的ScFv表達(dá)在細(xì)胞膜表面,然后以經(jīng)FITC標(biāo)記的BLyS抗原進(jìn)行共孵育,以流式細(xì)胞儀篩選出熒光強(qiáng)度最強(qiáng)、占細(xì)胞總數(shù)1%的細(xì)胞。提取并收集質(zhì)粒,作為下一輪篩選的質(zhì)粒庫。通過三輪篩選、每輪梯度降低抗原的濃度(1 μg/106cells-0.1 μg/106cells-0.01 μg/106cells)從而篩選出親和力較強(qiáng)的人源抗BLyS單鏈抗體。通過測(cè)序來獲得ScFv序列,并在IgBlast和IMGT上對(duì)獲得的ScFv序列進(jìn)行比對(duì)和分析。可見,在本部分研究中,我們成功通過篩選獲得了兩個(gè)全新的人源抗BLyS的ScFv序列,這些序列中的VH與VL都有著正確的骨架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)并且是有功能的。第二部分人源抗BLyS單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)及其初步活性鑒定本部分的研究目的主要是將獲得的ScFv序列整合進(jìn)真核表達(dá)載體p3457-his中構(gòu)建重組質(zhì)粒,表達(dá)、獲得ScFv抗體并對(duì)其活性進(jìn)行初定鑒定。我們利用基因重組技術(shù),通過PCR擴(kuò)增,酶切、酶連以及轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒,以菌液PCR、基因測(cè)序、質(zhì)粒電泳和酶切等方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定,并將兩種重組質(zhì)粒分別命名為p3457 B6-ScFv和p3457 B10-ScFv;將兩種重組質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞中,懸浮培養(yǎng)6-7 d后收取細(xì)胞上清,以SDS-PSGE凝膠電泳鑒定蛋白表達(dá)情況,在特定處出現(xiàn)有目的條帶；目的蛋白純化后以western blot檢測(cè)其純化情況；以BCA(bicinchoninic acid disodium)方法來對(duì)純化的蛋白進(jìn)行定量；以ForteBio Octet QK鑒定B-6 ScFv和B-10 ScFv的體外結(jié)合活性并測(cè)定兩者親和力常數(shù)；在受體結(jié)合阻斷實(shí)驗(yàn)中,我們將膜表達(dá)BLyS兩種受體(TACI和BAFFR)的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后分別與FITC-BLyS, FITC-BLyS+ScFv和等體積的PBS共孵育1 h,以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的遷移情況。結(jié)果顯示與FITC-BLyS+ScFv共孵育的細(xì)胞群其遷移程度明顯要弱于與FITC-BLyS共孵育的細(xì)胞群。至此,在本部分研究中,我們成功構(gòu)建了兩種重組質(zhì)粒并成功表達(dá)了相應(yīng)的抗體蛋白B-6 ScFv和B-10 ScFv,親和力測(cè)定顯示兩者的親和力常數(shù)分別為10 nM和3.08 nM,表明兩種單鏈抗體的親和力較高；兩者均能特異性結(jié)合BLyS抗原,顯示其具有一定的體外結(jié)合活性和受體阻斷活性。綜上所述,本研究成功利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型人源ScFv抗體庫篩選出了兩個(gè)全新的抗BLyS ScFv抗體及其序列并成功表達(dá)出了兩種親和力較高且有一定體外活性的人源抗BLyS單鏈抗體。本研究工作為后續(xù)進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ),并且為針對(duì)其他靶點(diǎn)的人源ScFv篩選提供了思路和方法。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王秀紅;周素芳;;基因工程抗體研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2007年02期

2 劉少嬌;李巍巍;楊黎明;陳彥田;齊念民;;PEI介導(dǎo)的大規(guī)�；蛩矔r(shí)轉(zhuǎn)染研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年01期

本文編號(hào)：2799441