【摘要】：目的:觀察間充質(zhì)干細(xì)胞上清液(MSC-CM)對2,5-己二酮(HD)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,并探討其作用機(jī)制。材料和方法:體外培養(yǎng)、純化Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),并收集其第5代MSC-CM。將實(shí)驗(yàn)分為四組:(1)空白對照組:不對PC12細(xì)胞進(jìn)行任何處理。(2)MSC-CM對照組:向PC12培養(yǎng)體系中加入40%的MSC-CM。(3)HD暴露組:PC12細(xì)胞暴露于20 mmol/L HD 24 h,制備PC12細(xì)胞損傷模型。(4)MSC-CM保護(hù)組:20 mmol/L HD作用于PC12細(xì)胞24 h后,分別加入10%、20%、40%體積的MSC-CM。以上各組用MTT法檢測細(xì)胞活性;Hoechst 33342觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率;Real-time RT-PCR檢測Bax、Bcl-2和BMSCs中NGF的表達(dá);Western-Blotting檢測Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素C(cytochrome c)以及BMSCs中NGF蛋白表達(dá)量;rhodamine 123法檢測線粒體膜電位(MMP)的變化;Bradford法檢測待測樣品單位蛋白中caspase-3活性;ELISA法對3-6代MSC-CM中NGF含量進(jìn)行測定。結(jié)果:1.MTT結(jié)果與空白對照組比較,MSC-CM對照組PC12細(xì)胞的活性無顯著差異(p0.05),而HD暴露組的PC12細(xì)胞活性顯著降低(p0.05)。MSC-CM保護(hù)組與HD暴露組相比,PC12細(xì)胞活性明顯提高(p0.05),且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。2.細(xì)胞凋亡結(jié)果Hoechst 33342觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)改變,對照組細(xì)胞核核質(zhì)均勻細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,HD暴露組細(xì)胞呈新月形,核仁消失,染色質(zhì)聚集移動,有特征性凋亡小體形成,而MSC-CM保護(hù)組PC12細(xì)胞特征性凋亡小體細(xì)胞有所減少;AV/PI雙染流式細(xì)胞儀對PC12細(xì)胞進(jìn)行凋亡率的檢測中發(fā)現(xiàn),HD暴露組PC12細(xì)胞的凋亡率較對照組顯著增加(p0.05),加入MSC-CM后PC12細(xì)胞凋亡率逐漸降低。3.Bax、Bcl-2的m RNA表達(dá)結(jié)果HD暴露組中,PC12細(xì)胞Bax的m RNA表達(dá)明顯高于對照組(p0.05),而加入MSC-CM后Bax的m RNA表達(dá)較HD暴露組明顯降低(p0.05),并且隨著MSC-CM體積的增加而降低;PC12細(xì)胞Bcl-2的m RNA表達(dá),HD暴露組較對照組明顯降低(p0.05),而MSC-CM保護(hù)組m RNA表達(dá)明顯高于HD暴露組(p0.05);Bax與Bcl-2 m RNA的比值,HD暴露組與空白對照組相比,比值明顯增加(p0.05),而MSC-CM保護(hù)組較HD暴露組比值降低(p0.05)。4.Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)結(jié)果HD暴露組PC12細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量顯著高于空白對照組(p0.05),而MSC-CM組Bax的蛋白表達(dá)較HD暴露組有所降低(p0.05),并且隨著MSC-CM體積的增加而減少;PC12細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá),HD暴露組中明顯低于空白對照組(p0.05),MSC-CM保護(hù)組明顯高于HD暴露組(p0.05),且隨著MSC-CM體積分?jǐn)?shù)的增加而增加;Bax與Bcl-2的比值Bax/Bcl-2,HD暴露組與空白對照組相比,其比值明顯增加(p0.05),MSC-CM保護(hù)組較HD暴露組比值降低(p0.05)。5.MMP的檢測結(jié)果HD暴露組PC12細(xì)胞較空白對照組相比其線粒體膜電位顯著降低(p0.05),MSC-CM保護(hù)組較HD暴露組逐漸增加,膜電位值由24.28%上升到38.15%、51.45%和66.47%。6.Cytochrome c的Western-Blotting結(jié)果線粒體內(nèi)cytochrome c蛋白表達(dá),HD暴露組較空白對照組顯著降低(p0.05),MSC-CM保護(hù)組與HD暴露組相比cytochrome c的蛋白表達(dá)明顯上升(p0.05);另一方面在胞漿中cytochrome c的蛋白表達(dá)情況與在線粒體中相反。7.Caspase-3活性的檢測結(jié)果HD暴露組與對照組相比,PC12細(xì)胞caspase-3的活性顯著增加(p0.05),而MSC-CM保護(hù)組與HD暴露組相比活性降低(p0.05)。8.NGF水平的檢測結(jié)果BMSCs中NGF的m RNA在3到6代中均有所表達(dá),而在第3代m RNA的表達(dá)量最高;蛋白表達(dá)量與Real-time RT-PCR結(jié)果相似;ELISA法測3到6代MSC-CM中NGF的含量根據(jù)相對曲線算出的MSC-CM中NGF相對值分別為52.41,49.17,24.11和23.38pg/ml。結(jié)論:HD誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡;MSC-CM對HD誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用;該保護(hù)作用可能與抑制線粒體依賴的caspase-3通路有關(guān);NGF在MSC-CM拮抗HD誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡中可能起到重要保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2

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