【摘要】： 研究背景乳源性的?-酪蛋白(β-CN)含有豐富的生物活性肽,這些生物活性肽在體內(nèi)發(fā)揮著各式各樣的生理功能,因此,?-酪蛋白被譽(yù)為乳蛋白中的戰(zhàn)略活性蛋白。制備和提取?-酪蛋白為研究?-酪蛋白及其中包含的生物活性肽具有重要的意義,也為開發(fā)乳品奠定一定基礎(chǔ)。傳統(tǒng)方法獲得?-酪蛋白主要是從乳中分離純化,但獲得的?-酪蛋白產(chǎn)量較低,且分離純化難度較大,為?-酪蛋白的研究和開發(fā)帶來不便。隨著生物技術(shù)飛速發(fā)展,利用基因工程手段直接獲得?-酪蛋白為人們提供了新的思路和方法。各種哺乳動物和人?-酪蛋白高度保守,尤其小鼠?-酪蛋白與人的?-酪蛋白又有很高的同源性,本研究以小鼠?-酪蛋白作為研究對象。 目的構(gòu)建小鼠?-酪蛋白基因重組體,在大腸桿菌內(nèi)誘導(dǎo)其表達(dá),純化?-酪蛋白并研究其酶解液的部分功能。 方法從哺乳期小鼠乳腺組織提取總RNA,通過RT-PCR獲得?-酪蛋白基因編碼序列,再與融合蛋白表達(dá)載體pGEX-KG連接,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-β-CN,將其轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α宿主內(nèi),在20℃,用低濃度的IPTG進(jìn)行長時間的誘導(dǎo),超聲破碎細(xì)菌后SDS-PAGE分析。利用?-酪蛋白基因重組體表達(dá)的融合蛋白氨基端帶有GST標(biāo)簽,用商品化的GST beads(Glutathione Sepharose 4B),親和層析的方法純化β-CN融合蛋白。以純化的β-CN融合蛋白為底物,用胰蛋白酶、糜蛋白酶作用底物60min、90min、120min、150min,得到不同時間段的酶解液。通過體內(nèi)和體外兩系列實驗,觀察了β-CN融合蛋白酶解液對大鼠和小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。 結(jié)果經(jīng)限制內(nèi)切酶酶切圖譜分析和DNA序列測定證實所構(gòu)建的質(zhì)粒pGEX-KG-β-CN,SDS-PAGE證實誘導(dǎo)表達(dá)后所獲得的融合蛋白分子量為52KD,表達(dá)量占菌體蛋白的12.4%且主要存在于上清液中。純化后產(chǎn)物經(jīng)胰蛋白酶、糜蛋白酶作用90min、120min,其對大鼠和小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化有明顯的促進(jìn)作用。 結(jié)論成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-β-CN,并在大腸桿菌中獲得了可溶性表達(dá)。成功純化了融合蛋白,其酶解液對大鼠和小鼠體內(nèi)外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R346
【圖文】：

圖 2 RT-PCR 產(chǎn)物的電泳圖Fig 2 Electrphoresis of the RT-PCR Product DNA Marker; 2-5: PCR product of -casein cDN 的活化EX-KG 用雙蒸水從濾紙上洗脫下來，轉(zhuǎn)挑取 LB 瓊脂平板（含氨芐青霉素 100μg培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增，小量提取質(zhì)粒經(jīng) 1％

的克隆菌 pGEX-KG-β-CN 培養(yǎng)至對數(shù)生長0－6 小時，各樣本取相同的蛋白量作 SDS附近能見到一條明顯的條帶，與我們預(yù)計，對照組（0 小時）在 52 kDa 處未見條帶X-KG-β-CN 在大腸桿菌種得到了正確的果掃描，計算 52kDa 處蛋白條帶的積分值白表達(dá)隨誘導(dǎo)時間增加而增多，誘導(dǎo) 4 小達(dá)的最佳時相為 4 小時。進(jìn)一步超聲破碎白大部分存在上清液中，這說明了我們的續(xù)的純化提供了方便。蛋白量為 185 μg/m見圖 6 和 7。7 6 5 4 3 2 1 M

圖 7 細(xì)菌蛋白質(zhì)的 SDS-PAGEFig 7 SDS-PAGE of bacterium protein,3: bacterial protein induced by IPTG for 2, 3, 4 h, respectived by IPTG for 4h; 5:bacterial protein in precipitation indu親和層析純化后的 GST-β-CN 融合蛋白-KG-β-CN 經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，菌體超聲破碎，one SepharoseTM4B)結(jié)合，用還原型谷胱苷肽洗GE，可見 52kDa 處有一明顯的蛋白條帶。如圖度為 0.58mg/ml，純化后的蛋白純度為 95%左右

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 馬玉敏,王恬,許若軍;牛初乳酶解物對離體犢牛小腸上皮細(xì)胞增殖和吸收功能的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2002年02期

2 林福玉,楊曉,王健,黃培堂;小鼠β-酪蛋白基因的克隆及序列分析[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2002年01期

3 崔春萍,石炳興,劉鋮,段海峰,王立生,王清明,吳祖澤;肝刺激物促肝細(xì)胞增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的初步研究[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2005年02期

4 鄒國林;桂興芬;鐘曉凌;朱汝t

本文編號：2794563