【摘要】： 研究背景及目的 人類白細胞抗原(HLA)是迄今發(fā)現(xiàn)的人類最復(fù)雜，最具多態(tài)性的遺傳系統(tǒng)。2001年2月召開的十三屆國際組織相容性專題會議確定已發(fā)現(xiàn)的HLA等位基因已達到1340個。HLA系統(tǒng)在抗原識別與呈遞、免疫應(yīng)答與調(diào)控等方面起著極其重要的作用，是影響器官移植物長期存活和造血干細胞移植成敗的關(guān)鍵因素之一�，F(xiàn)階段HLA分型，臨床上多采用血清學(xué)分型方法。但血清學(xué)方法不僅存在著廣泛的交叉反應(yīng)和難以找到理想的抗血清而出現(xiàn)技術(shù)上的困難和分型判斷誤差，還會有許多新發(fā)現(xiàn)的等位基因卻缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，導(dǎo)致個別基因型無法檢出。以1996年第12屆國際組織相容性專題研討會為標(biāo)志，HLA的分型技術(shù)全面進入DNA分型階段。 現(xiàn)今國際上較常采用PCR-SSP和PCR-SSOP對HLA單個等位基因位點分型，其準(zhǔn)確性雖優(yōu)于血清學(xué)方法，但操作極為繁瑣，不適合大樣本檢測�；蛐酒墙臧l(fā)展起來的一種具高通量、集成化為特點的檢測平臺，其優(yōu)勢極其適合多態(tài)性復(fù)雜的HLA系統(tǒng)分型研究。目前國內(nèi)外此方面的報道諸多，但尚沒有成熟的HLA分型芯片問世。本研究使用本實驗室建立的技術(shù)流程制作寡核苷酸芯片，對HLA-DQA1位點進行等位基因分型檢測，旨在建立一套成熟的寡核苷酸芯片分型技術(shù)，用于復(fù)雜的HLA系統(tǒng)的分型研究。 材料與方法 1．人全血基因組DNA的提取 采用改良的酚/氯仿法，以分光光度法檢測提取的基因組DNA的濃度及純度 2．樣本靶序列的PCR擴增 在HLA-DQA1第二外顯子保守區(qū)域設(shè)計一對引物，并在正義鏈引物5’作FITC標(biāo)記，以熒光標(biāo)記單鏈為優(yōu)勢鏈，行不對稱擴增。 3．寡核苷酸探針的制備 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫新近公布的HLA-DQA1等位基因序列，設(shè)計四組共16條特異性寡核苷酸分型探針，并在各5’端做氨基修飾。以預(yù)先摸索的優(yōu)化條件重懸冷凍干燥的探針。 4．基片的處理和制備 取蓋玻片，鉻酸洗液中浸泡過夜，洗凈，NaOH 浸泡，丙酮化，手臂分子連接，清洗，烘烤固定，醛基修飾。 5.寡核昔酸微陣列的制備以同等濃度的反義鏈引物咫作為陽性對 照，以探針緩沖液作為空白對照，以無關(guān)探針作為陰性對照，與制備好的16 條寡核昔酸探針，同時加人384孔板。使用生物芯片點樣儀，制成預(yù)先設(shè)計 好的微陣列。點樣后水化、烤干固定，備用。 6.封閉與核酸分子雜交按本室方法，將制備好的寡核昔酸微陣列，清 洗，封閉。PCR產(chǎn)物加雜交液稀釋混勻，覆蓋于各微陣列，置人雜交艙中 55℃保溫3Omin。 7.洗滌與檢測分析取出雜交芯片，沖去蓋片。用預(yù)熱至60℃的洗 液，即1 xSSC/0.1%SDS，O.sxSSC/0.1%SDS，0.lxSSC行梯度洗滌， ddHZO洗凈吹干。掃描儀檢測，CCD成像系統(tǒng)分析雜交信號，確定分型結(jié) 果。 結(jié)果 1.HLA一DQAI基因片段的PCR擴增 以提取的全基因組DNA為模板，行PCR擴增，產(chǎn)物用聚丙烯酞胺凝膠 電泳檢測，可見條帶清晰，產(chǎn)物長度538bp，與設(shè)計相符。 2.寡核昔酸探針制備條件的優(yōu)化 以PH二9，0.IM的碳酸鹽緩沖液，重懸為100林M探針為最優(yōu)條件。 3寡核營酸芯片分型結(jié)果的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性 分型結(jié)果與DNA測序相符合，重復(fù)5次雜交重現(xiàn)率91 .2%。 結(jié)論 基甲芯片作為一種新興的檢測技術(shù)平臺，具有明顯的高通量、集成化并 行檢測的優(yōu)勢，且結(jié)果直觀，易于保存和攜帶，非常適合組成復(fù)雜的HLA系 統(tǒng)的分型檢測。有關(guān)文獻提示，本室研制的寡核昔酸芯片制作流程相對簡 單，易于操作，且穩(wěn)定性好，特異性和靈敏性都能滿足基因分型的需要，是適 合廣泛應(yīng)用的技術(shù)平臺。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：Q789

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 林源,闕庭志,李莉,趙珍敏,周月琴;用反相雜交技術(shù)對HLA-DQA1基因分型及其應(yīng)用[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2000年01期

本文編號：2789288