【摘要】：腎臟不僅能排泄體內(nèi)代謝廢物,維持機(jī)體鈉、鉀、鈣等電解質(zhì)穩(wěn)定及酸堿平衡,還具有內(nèi)分泌功能。因此,腎臟對(duì)維持整個(gè)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡至關(guān)重要。有研究表明:當(dāng)腎臟功能受損時(shí),其鄰近和遠(yuǎn)端器官如心、肺、肝、腸和腦等的功能也會(huì)嚴(yán)重受損[1]。腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是急性腎動(dòng)脈阻斷或腎臟移植等臨床治療過(guò)程中常見的病理生理過(guò)程。它也是導(dǎo)致腎移植后功能恢復(fù)延遲或病人發(fā)生急性腎衰的重要因素。當(dāng)腎臟發(fā)生缺血再灌注時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧族(reac-tive oxygen species,ROS),使腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài),這也是缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過(guò)氧化氫(H2O2)等。ROS化學(xué)性質(zhì)非常活潑,可以破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA和脂類等生物大分子,從而影響細(xì)胞功能,甚至引起細(xì)胞和組織死亡。Peroxiredoxin(Prx)是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類過(guò)氧化物酶系,Prx VI是其家族成員之一。Prx VI在哺乳動(dòng)物肺部尤其是肺泡II型上皮細(xì)胞表達(dá)非常豐富。研究表明:Prx VI具有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的生物活性,其功能主要是負(fù)責(zé)還原H2O2和磷脂過(guò)氧化物等。用高濃度氧、百草枯、H2O2等物質(zhì)處理大鼠肺上皮細(xì)胞引起氧化應(yīng)激反應(yīng)后,Prx VI的m RNA和蛋白水平會(huì)明顯增強(qiáng)。當(dāng)誘導(dǎo)Prx VI在肺上皮細(xì)胞系過(guò)表達(dá)時(shí),能明顯增強(qiáng)細(xì)胞分解H2O2的能力,抑制細(xì)胞過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生。Prx VI基因敲除小鼠肺組織內(nèi)H2O2和MDA含量明顯高于對(duì)照組。以上這些說(shuō)明Prx VI在肺組織內(nèi)具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激功能,在清除ROS防止肺組織過(guò)氧化損傷中可能發(fā)揮重要作用。肺臟是機(jī)體內(nèi)對(duì)氧含量非常敏感的臟器之一。當(dāng)RIRI發(fā)生時(shí),肺臟是否也會(huì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài),遭受過(guò)氧化損傷?Prx VI的表達(dá)水平如何改變?未見報(bào)道。本研究通過(guò)采用無(wú)損傷動(dòng)脈夾鉗夾腎動(dòng)脈法建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型。24小時(shí)后觀察肺組織內(nèi)MDA含量、H2O2含量,以及Prx VI基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化,探討腎臟缺血再灌注損傷時(shí)肺組織的過(guò)氧化損傷程度,以及Prx VI在缺血再灌注損傷過(guò)程中的抗氧化作用,為防治RIRI引起的肺組織損傷提供一條新思路。目的:觀察大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型肺內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)和抗氧化酶Prx VI基因和蛋白水平的表達(dá)變化,探討Prx VI在RIRI誘發(fā)的肺組織過(guò)氧化損傷中的作用。方法:1腎臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材雄性Wistar大鼠12只,體重200±10 g,購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)和腎臟缺血再灌注損傷組(RIRI),每組各6只。用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg),參照余曉東等人的方法制備腎臟缺血再灌注損傷模型。RIRI組大鼠開腹后暴露其雙側(cè)腎臟,先切除右腎,然后鈍性分離左腎動(dòng)脈,在靠近腎門處用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈,觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45 mins后松開動(dòng)脈夾,恢復(fù)血液供應(yīng),肉眼可見腎動(dòng)脈充盈,腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r紅色,表明再灌注成功。對(duì)照組大鼠開腹后只切除右腎,分離左腎動(dòng)脈,但不夾閉左腎動(dòng)脈。24小時(shí)后收集血液,3000rpm離心10min,分離血清用于肌酐(Serum Creatinine,SCr)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)濃度測(cè)定;處死大鼠取腎臟和肺臟,將腎臟于4%多聚甲醛中固定進(jìn)行HE染色,觀察腎臟的形態(tài)學(xué)改變。將肺臟置于液氮中用于Prx VI m RNA和蛋白水平測(cè)定以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)和H2O2含量測(cè)定。2測(cè)定指標(biāo)及方法2.1血清SCr和BUN水平測(cè)定血清SCr濃度采用苦味酸法測(cè)定;血清BUN濃度采用酶偶聯(lián)速率法測(cè)定。2.2 HE染色觀察大鼠腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明,石蠟包埋后,切片厚約5μm,蘇木精伊紅染色,日本產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。2.3大鼠肺組織MDA含量測(cè)定將從-70℃冰箱中取出的肺組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液,PH7.4,1mmol/L鹽酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm 4℃離心20min,取上清即制成10%肺組織勻漿,肺組織勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)定。2.4大鼠肺組織H2O2含量測(cè)定將從-70℃冰箱中取出的肺組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液,PH7.4,1mmol/L鹽酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm 4℃離心20min,取上清即制成10%肺組織勻漿。肺組織勻漿內(nèi)H2O2含量采用鉬酸比色法測(cè)定,以每克樣本蛋白所含的過(guò)氧化氫的量(mmol/g pro)表示。2.5大鼠肺組織Prx VI m RNA水平測(cè)定用TRIzol法提取肺內(nèi)總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照,進(jìn)行RT-PCR。分別以Prx VI的擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量2.6大鼠肺組織Prx VI蛋白水平測(cè)定采用Western blot法測(cè)定大鼠肺組織Prx VI蛋白水平。將大鼠肺組織制成勻漿,離心后取上清。用改良Lowry法進(jìn)行蛋白總量測(cè)定.電泳的蛋白上樣量為64 ug.經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜和封閉處理后,在PVDF膜上加入兔抗Prx VI抗體,室溫靜置過(guò)夜。再加入熒光標(biāo)記的抗兔Ig G抗體.在雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進(jìn)行圖像數(shù)值分析。結(jié)果:1大鼠腎組織的形態(tài)學(xué)改變光學(xué)顯微鏡下可見正常組大鼠腎血管球、腎小囊、近曲、遠(yuǎn)曲小管及集合管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整。而RIRI組大鼠可見腎血管球萎縮,體積變小;腎小囊腔擴(kuò)張;腎小管管腔明顯擴(kuò)張,個(gè)別近曲小管上皮細(xì)胞水腫,胞漿疏松化;腎間質(zhì)水腫,腎小管間隙擴(kuò)大;集合管出現(xiàn)管腔擴(kuò)張、上皮水腫等改變。2血清SCr水平Con組大鼠血清中SCr的濃度為103.444±8.465μmol/L,而RIRI組血清SCr的濃度為131.153±17.814μmol/L。RIRI組大鼠血清SCr濃度明顯高于Con組(P0.05)。3血清BUN水平Con組大鼠血清BUN的濃度為4.462±0.541 mmol/L,而RIRI組血清BUN的濃度為13.685±4.397 mmol/L。RIRI組大鼠血清BUN的濃度明顯高于Con組(P0.05)。4肺勻漿內(nèi)MDA的含量Con組大鼠肺勻漿內(nèi)的MDA含量為7.63±1.68mmol/g,而RIRI組肺勻漿內(nèi)的MDA含量為10.89±1.74 mmol/g。RIRI組大鼠肺勻漿內(nèi)的MDA含量明顯高于Con組(P0.01)。5肺勻漿內(nèi)H2O2的含量Con組大鼠肺勻漿內(nèi)的H2O2含量為16.51±2.39 mmol/g,而RIRI組肺勻漿內(nèi)的H2O2含量為21.85±4.16 mmol/g。RIRI組大鼠肺勻漿內(nèi)的H2O2含量明顯高于Con組(P0.05)。6肺組織Prx VI m RNA的相對(duì)表達(dá)量采用RT-PCR的方法測(cè)定大鼠肺組織內(nèi)Prx VI m RNA的相對(duì)表達(dá)量。Con組肺組織內(nèi)Prx VI m RNA的相對(duì)表達(dá)量為0.72±0.17,RIRI肺組織內(nèi)Prx VI m RNA的相對(duì)表達(dá)量為1.09±0.23,RIRI組大鼠肺組織內(nèi)Prx VI m RNA水平明顯高于Con組(P0.01)。說(shuō)明RIRI組大鼠肺組織內(nèi)Prx VI的基因表達(dá)水平升高。7大鼠肺組織Prx VI蛋白水平Con組大鼠肺組織內(nèi)Prx VI的蛋白表達(dá)水平為0.62±0.13,RIRI組大鼠肺組織內(nèi)Prx VI的蛋白表達(dá)水平為0.88±0.16。RIRI組Prx VI蛋白水平明顯高于對(duì)照組(P0.01)。說(shuō)明RIRI組大鼠肺組織內(nèi)Prx VI的蛋白表達(dá)水平升高。結(jié)論:1切除右腎后在靠近腎門處用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈可成功建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。2腎臟缺血再灌注損傷可使肺組織處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài),引起肺組織的過(guò)氧化損傷。3 Prx VI的基因和蛋白表達(dá)水平在RIRI模型肺組織中明顯增強(qiáng)。提示Prx VI可能參與了缺血再灌注所誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng),對(duì)肺組織具有保護(hù)功能。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R692;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 余曉東;廖波;鄧顯忠;姜果;朱平宇;魯棟梁;唐鐵龍;楊雪松;陳雙全;程樹林;;一種新型實(shí)用的大鼠腎缺血再灌注損傷模型的建立[J];重慶醫(yī)學(xué);2011年13期

本文編號(hào)：2789489