【摘要】： 目的：克隆人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（hBMP-2）完整成熟肽基因，并在大 腸桿菌中高效表達，獲得具有生物活性的重組人BMP-2。方法：①依 據(jù)Genbank中hBMP-2的序列合成兩條引物，從人胎兒骨組織中提取的 總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）得到hBMP-2完整成熟 肽基因。將所得的基因片段插入克隆載體pUC-19中，克隆并測序。② 設(shè)計出5'端突變引物，通過PCR的方法，將hBMP-2基因5'端突變 為E.Coli所偏好的密碼子，以利于其在E.Coli中的表達。將突變的 hBMP-2基因插入表達載體pBV220中，轉(zhuǎn)化E.Coli BL21，溫度誘導(dǎo)，并 探討不同活化時間與誘導(dǎo)時間對表達的影響。③將表達所得包涵體，經(jīng) DEAE陰離子交換層析和S-300分子篩凝膠過濾純化，體外復(fù)性獲得 rhBMP-2，用小鼠肌袋模型測活。結(jié)果：①測序結(jié)果顯示所克隆基因與 Genbank上完全一致，預(yù)想突變位點已突變。②重組質(zhì)粒pYR （pBV220-hBMP-2'）經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切分析表明：突變的 hBMP-2基因成功插入表達載體pBV220中，轉(zhuǎn)化E.Coli BL21后溫度 誘導(dǎo)，最佳的活化狀態(tài)為OD_(600nm)≈0.45，最佳誘導(dǎo)時間為4h。表達量 達30％。③重組hBMP-2經(jīng)純化后純度達95％以上，4周后見小鼠肌肉 內(nèi)有新生骨生長。結(jié)論：①克隆了hBMP-2完整成熟肽基因并成功將 hBMP-2基因的5'端突變?yōu)镋.Coli所偏好的密碼子。②重組hBMP-2 表達載體pYR在E.Coli BL21溫度誘導(dǎo)表達，所得重組蛋白具有較理想 的成骨活性。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2000
【分類號】：R341

【引證文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 郭旺明;重組大腸桿菌工業(yè)生產(chǎn)三種蛋白藥物過程中的關(guān)鍵技術(shù)[D];浙江大學(xué);2012年

本文編號：2787365