【摘要】：目的： 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI TOF MS)是最近發(fā)展起來的一種分析化學(xué)技術(shù)，能提供各具特征的細(xì)菌質(zhì)量指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)檢測和鑒定的目的。本研究通過對MALDI TOF MS分析細(xì)菌的方法進(jìn)行系統(tǒng)的研究，闡明影響MALDI分析的重要實(shí)驗(yàn)因素的作用，并建立MALDI TOF MS分析細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法，從而實(shí)現(xiàn)不同菌種和同一種內(nèi)不同菌株的鑒定，為建立炭疽芽孢桿菌和鼠疫耶爾森氏菌的質(zhì)量圖譜數(shù)據(jù)庫奠定基礎(chǔ)，從而能夠快速準(zhǔn)確地檢測和鑒定我國不同來源的炭疽芽孢桿菌和鼠疫耶爾森氏菌，在生物恐怖或傳染性疾病爆發(fā)時，作為微生物法醫(yī)學(xué)的一種重要技術(shù)，快速、準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌，并追蹤其來源。 方法： 根據(jù)研究目的，選擇以下菌株進(jìn)行試驗(yàn)：革蘭氏陽性菌包括含芽孢的炭疽芽胞桿菌和不含芽孢的金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌包括鼠疫耶爾森氏菌，大腸桿菌和胞外多糖含量高的洋蔥伯克霍爾德氏菌；同一屬內(nèi)不同種的細(xì)菌(伯克霍爾德氏菌屬的7個種)；同一種內(nèi)的不同菌株(11株大腸桿菌和20株金黃色葡萄球菌)。在試驗(yàn)中，以炭疽芽孢桿菌和鼠疫耶爾森氏菌為目標(biāo)菌，試驗(yàn)了不同的樣品處理方法包括直接分析，溶劑處理(單一溶劑處理和組合溶劑處理)和酶處理(溶菌酶和胰蛋白酶)，及不同的實(shí)驗(yàn)因素包括基質(zhì)、基質(zhì)溶劑、處理用溶劑、菌體的量、點(diǎn)樣方法，通過MALDI TOF MS分析提供的細(xì)菌各種成分的質(zhì)量信息，應(yīng)用Microbelynx軟件進(jìn)行比較分析，確定標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方法和影響分析結(jié)果的重要實(shí)驗(yàn)因素。 在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法建立后，對方法的重復(fù)性包括同一樣品的重復(fù)性和批間樣品的重復(fù)性，及方法的可行性包括安全性和穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)的試驗(yàn)，從而能夠應(yīng)用于分析我國不同來源的炭疽芽胞桿菌和鼠疫耶爾森氏菌。 結(jié)果： 本研究通過MALDI TOF MS分析細(xì)菌方法的研究，確定了影響分析結(jié)果的重要實(shí)驗(yàn)因素，建立了一種用于MALDI TOF MS的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法，具體的實(shí)驗(yàn) 一一一一一一遭燮鯉鯉巡壑通竺型暨 方案為4 mg的細(xì)菌依次采用。，1%TFA和氯仿:甲醇(l:l)處理后，沉淀的菌體 重懸于0.1%TFA中，改進(jìn)的干滴法點(diǎn)樣�；|(zhì)溶液為CHCA溶于乙睛:甲醇:水 (l:l:l)，含有0.1%甲酸和0.01 M 18一冠一6。 應(yīng)用此方法，在m/z 2 000一10 000范圍內(nèi)根據(jù)各自的特征圖譜可區(qū)分不同特性 的細(xì)菌(不同屬內(nèi)的細(xì)菌)包括炭疽芽抱桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠疫耶爾森氏 菌、大腸桿菌和洋蔥伯克霍爾德氏菌;伯克霍爾德氏菌屬的不同菌種;大腸桿菌 和金黃色葡萄球菌的不同菌株。 同一樣品和批間樣品的重復(fù)性較好;安全性試驗(yàn)中，鼠疫耶爾森氏菌采用建 立的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法處理后即能完全滅活，但未能實(shí)現(xiàn)炭疽芽抱桿菌的滅活目的; 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，樣品處理后放置7天，能獲得與樣品處理后立即分析較為一致的 結(jié)果。 結(jié)論: 本研究完成了MALDI TOF MS分析細(xì)菌方法的標(biāo)準(zhǔn)化，闡明了影響MALDI 分析細(xì)菌的重要實(shí)驗(yàn)因素，建立了一種 MALDI分析細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法，分析 過程簡單、快速、重復(fù)性較好。該方法能提供較多的質(zhì)量信息區(qū)分不同特性的細(xì) 菌(不同屬內(nèi)的細(xì)菌)包括含芽抱或不含芽抱的革蘭氏陽性菌，及革蘭氏陰性菌 包括胞外多糖含量高和低的細(xì)菌，同一屬內(nèi)的不同菌種和同一種內(nèi)的不同菌株。 安全性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示，采用標(biāo)準(zhǔn)方法處理細(xì)菌后，鼠疫耶爾森氏菌即能 完全滅活，在7天內(nèi)分析能得到穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果;炭疽芽抱桿菌的滅活還需進(jìn)一 步試驗(yàn)，在7天內(nèi)分析也能得到穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果�；诮⒌臉�(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法能夠 建立強(qiáng)大的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，通過快速搜索實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的鑒定，在微生物法醫(yī)學(xué)的 追蹤鑒定中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R378
【圖文】：

圖20.批間RMS值計(jì)算的界面。(1，待比較的一批樣品的12個樣品點(diǎn);2，待比較的一批樣品對應(yīng)的數(shù)據(jù)文件名;3，比較的2批樣品的24張圖譜的RMS值，由于界面的空間有限，不能給出全部的RMS值;4，2批樣品對應(yīng)的數(shù)據(jù)文件名;5，己建入數(shù)據(jù)庫中的待比較的另一批樣品)3.的用性

圖16A的炭疽芽抱桿菌同一樣品的12張圖譜的RMS值。

示同一樣品的12個樣品點(diǎn)的圖譜的RMS值均小于3，重復(fù)性品的重復(fù)性試驗(yàn)，19分別是炭疽芽抱桿菌和鼠疫耶爾森氏菌進(jìn)行3次重復(fù)培養(yǎng)譜。表7列出了3批樣品的批間RMS值。圖20為批間RMS值

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 黃躍才;幾種鐮刀菌的活性檢測研究[D];貴州大學(xué);2008年

本文編號：2787625