【摘要】： 基因工程疫苗多以單一蛋白作為抗原，其免疫效果常不盡人意，通常需要使用佐劑來提高此類疫苗的免疫效果。 霍亂腸毒素B亞單位(CTB)一直是效果較為公認的粘膜免疫佐劑，但近年文獻報道重組CTB與抗原混合后誘導S-IgA產(chǎn)生的能力弱或無，但誘導血清IgG作用較強。CTB的佐劑活性主要依賴其與細胞表面神經(jīng)節(jié)苷酯(GM_1)結(jié)合的活性。由于CTB主要通過激活Th2途徑發(fā)揮其佐劑活性，但Th2途徑可產(chǎn)生IL-4，IL-4能選擇性地促進IgE合成，因而認為CTB可引起變態(tài)反應(yīng)。 大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)是近年報道較多的粘膜免疫佐劑，因其腸毒性而在實際應(yīng)用中受到限制。LT分子結(jié)構(gòu)與CT類似，一個A亞單位和五個相同的B亞單位組成。A亞單位具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性，是毒素的毒性部位。B亞單位能與哺乳動物細胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂GM_1結(jié)合，介導A亞單位進入靶細胞。不少研究結(jié)果證實，將LT第63位絲氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬耐蛔凅w(LTK63)的毒性幾乎完全消失，但其免疫佐劑活性不變。很多文獻報道，單一使用LTKA63或LTB也具有粘膜免疫佐劑活性。LTB的佐劑作用也依賴其與細胞表面神經(jīng)節(jié)苷酯(GM_1)結(jié)合的活性，LTKA63的作用機制尚不清楚，但大部分研究者認為與其ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性無關(guān)。LT主要激活Th1途徑，其次是Th2途徑，故認為LT一般不引起 浙江大學碩士學位論文 中艾方要 變態(tài)反應(yīng)。令人感興趣的是，LTKA63和LTB佐劑活性的作用機制不同，兩者合用可能有協(xié) 同效應(yīng)。 綜上所述，LTK63、LTKA63或LTB較之CTB更適合作為D服基因工程疫苗的佐劑。 實驗 方法 1．菌株來源及培養(yǎng) 大腸桿菌4485株（ECOli 44815）購自中國藥品生物制品檢定所。將大腸桿菌44815 株接種于LB瓊脂平板上，37oC培養(yǎng)24 h。挑取單個菌落進行革蘭染色鏡檢，若是革蘭陰 性、中等大小桿菌者，再次轉(zhuǎn)種培養(yǎng)。加熱滅活的霍亂弧菌樂74株培養(yǎng)物由浙江省醫(yī)學科 學院何浙生研究員提供。 2．細菌基因組DNA的制備 采用常規(guī)的苯酚一氯仿法提取大腸稈菌 4481株與霍亂弧菌東 74株培養(yǎng)物的基因組 DNA，經(jīng)無DNA酶的RNA酶消化后，再用苯酚一氯仿法提取的DNA溶于TE緩沖液中 作為PCR的模板，用分光光度法測定DNA的濃度和純度。 3．PCR 根據(jù)報道的 LTA、LTB和 CTB基因序列設(shè)計引物，采用 PCR擴增 LTA、LTB和 CTB 基因，浚乙錠預染色的1．5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。 LTA 基因擴增的引物序列：上游 了CCG GAT ATC ATG AAA AAT ATA ACT TTC－3’（ECORV），廠游 5’－CCG CMM TAT TCA TAA TTC ATC CCG－3’（Xhol）。反應(yīng)體積 100 ql，內(nèi)含 25 pmol引物、2．5 mol／L dNTP、20 mol／L MgCI，、3．0 U EX Taq酶、100 ng DNA 模板和IXP＊R緩沖液（pH8．8）。P＊R反應(yīng)參數(shù)為：94℃sffi川XI cy。ie；94℃305，50℃ 305，72℃60 S，x10。wies：94℃祁S，5丁C30S，72℃70 S（以后每循環(huán)增加105），X20＊嚇1＊S： 720C10min，XI cycle。預期的LTA基因目的擴增片段人小為777hp。 LTB＄1lXllEJ791：x脅上游 5’－CCG pG AAT AAA GTA AAA TA－3’（ECOIU），卜 游5’－CCG CTMGAG CTA GT T TTC CAT ACT GA－3’（Xhol）。反應(yīng)體積100 HI，內(nèi)含 25 pmol引物、2．5 mol／L dNTP、20 mol／L MgCI。、30 U EX Taq酶、100 ng DNA模板和 1 XPCR緩沖液（pH88）。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94’C5min，XI Cycle；94”C30S，50’C305，72 ～2～ 一 ’C45S，X10cycles；94’C305，50’C305，72’C505（以后每浙增加SS），X20cycles；72 C10min，XI cycle。預期的 Lh基因目的擴增片段人小為 375 hP。 CTBgnch上游了－CCGAfATGATTAAATTAAAAThTG－3’（ECOR！）， 下游5’－CCG pATATC T TATA ATATT T口C C人TAC、3’（xho�。７磻�(yīng)體積10O山，除引物和 模板不同外，所有參與反應(yīng)的成分、濃度及反應(yīng)參數(shù)與Lh扭珊飛纖酮。預期的Ci基岡 日的擴增片段大小為 375 hp。 4T七克隆和核旮酸序列測定 采用上海申能博彩生物科技有限公司（SNBC）的 3S PCR Product Purification Kit VZ刀 回收目的擴增片段。目的擴增片段連接于pUCm＊載體中，形成用于測序的pUCm－TLTA、 pUCm－TLTB和pUCm－TCTB重組質(zhì)粒。經(jīng)蘭白篩選的陽性克隆擴增后用堿變性法提取重 組質(zhì)粒，酶切鑒定后用雙脫氧鏈末端終止法測定插入片段的核昔酸序列。所獲得的序列與 GeneBank登錄的大腸桿菌LTA、LTB和霍亂弧菌CTB序列進行核昔酸和氨基酸同源性比 較。 5．LTA基因點突變 LTA基因點突變?yōu)長TKA63的工作委托SNBC完成。 6．原核表達系統(tǒng)的構(gòu)建 LTKA63原核表達載體的構(gòu)建：采用EcoRV和Xhol ／X酶切pUCm－TLTKA63和表達 質(zhì)粒 pET32a，目的片段經(jīng)回收后連接。LTB和 CTB原核表達載體的構(gòu)建：EcoRI和 Xhol 雙酶切pUCm－TLTB、pUCm－TCTB和表達質(zhì)粒pET32a，目的片段經(jīng)回收后連接。將獲得 的表達載體pET32aLTKA63、pET32a－LTB和pET32a－CTB轉(zhuǎn)化于Ecoll BLZDE3表達 宿主菌中，
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R346
【圖文】：

:l江’A、LTB和C丁B基因的PCR擴增泳道M:250bpDNALaddde:Marker泳道1，2:人腸桿菌尸CR擴增產(chǎn)物(Ll’A泳道4，5:人腸桿菌PCR擴增產(chǎn)物(LTB泳道7，8:人腸桿菌PCR擴增產(chǎn)物(CTB泳道3，6，9:空自對照第四部分TA克隆和測序oH5a，美國Invitrogen公司。購自上海申能博彩(sNBc)生物有限公司，

2)取10川酶切產(chǎn)物與等體積Zx電泳上樣緩沖液混合，加入含1“創(chuàng)ml澳乙錠的1.6%瓊脂糖凝膠上樣孔，直流100V電泳30min，紫外檢測儀下觀察結(jié)果并用151000凝膠成像系統(tǒng)保存(圖2，3)。1000bP750bP~~777bP圖2:pUCm一T一LTKA63EeoRV和Xhol雙酶切圖譜泳道M:250bpoNALadderMarker泳道l，2:pUCm一LTKA63經(jīng)Eeo卿和xhol雙酶切后~23~

LTB不11pUCm一T-CTBEeoRI和x100bpoN人Ladde「Marker分別為pUCm一T-LTB和pUCm·T-CTB，委托上海博亞生物技術(shù)有限公序儀上測定插入片段的核營酸序列l(wèi)斗〕Un刁.、」勺1片‘賈月.月.。、，{認，A嘩P川.臼飛3r獷〕1;日。翎A嘩P而^一10之IJr勺n6，腸6沁，00別內(nèi)，L‘乃，C成書(奮乙創(chuàng)盯~丁幾下G二O二人G二印〕‘認〕個爾1叻O奮O亡Zt亡個口、Gl沐CT乍亡戒筋T八(旨住從為二2蘇仁嘛:。

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 徐穎華;張庶民;;百日咳的研究現(xiàn)狀[J];中華流行病學雜志;2006年08期

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 徐穎華;百日咳桿菌免疫學和分子生物學檢測方法的建立及疫苗株基因序列分析[D];中國藥品生物制品檢定所;2005年

本文編號：2782657