【摘要】： 本文主要采用原子力顯微術(shù)(AFM)和近場(chǎng)光學(xué)顯微術(shù)(NSOM)對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞的表面形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了納米級(jí)高分辨的成像研究，并結(jié)合量子點(diǎn)探針標(biāo)記技術(shù)和NSOM成像技術(shù)，對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞表面的一些膜蛋白分子進(jìn)行高分辨的熒光成像，突破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微技術(shù)由于衍射極限造成的分辨率限制，實(shí)現(xiàn)了直接使用光學(xué)方法對(duì)細(xì)胞膜表面分子進(jìn)行原位的分子級(jí)的高分辨觀測(cè)，對(duì)膜表面分子的數(shù)量和定位進(jìn)行了研究。在此基礎(chǔ)上，對(duì)不同生理狀態(tài)下淋巴細(xì)胞的形態(tài)和其表面分子的變化進(jìn)行了觀測(cè)。對(duì)掃描探針顯微術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了一些初步的探討。 主要工作包括應(yīng)用AFM和NSOM，對(duì)處于靜息期的單個(gè)人外周血淋巴細(xì)胞的表面形態(tài)及光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了觀測(cè)，AFM觀測(cè)結(jié)果顯示靜息期的單個(gè)淋巴細(xì)胞基本都呈規(guī)則的球形，表面較為平整，但也存在一些細(xì)微突起的結(jié)構(gòu)。NSOM的結(jié)果則顯示了未經(jīng)染色處理的淋巴細(xì)胞內(nèi)部豐富的光學(xué)信息，可見到細(xì)胞內(nèi)部明確的區(qū)域劃分，以及一些呈現(xiàn)獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)的區(qū)域，并對(duì)不同類型的NSOM成像結(jié)果進(jìn)行了探討。 在此基礎(chǔ)上，使用AFM和NSOM進(jìn)一步對(duì)活化的淋巴細(xì)胞的形態(tài)和熒光性質(zhì)進(jìn)行了觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著活化時(shí)間的增加，淋巴細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的改變，體積明顯變大，細(xì)胞表面粗糙度明顯增加，表面微觀結(jié)構(gòu)明顯趨向更為復(fù)雜，并出現(xiàn)一些新的構(gòu)造。NSOM成像的結(jié)果則首次清晰顯示了淋巴細(xì)胞活化過程中其自發(fā)熒光的變化，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)逐步加強(qiáng)。熒光的分布則呈現(xiàn)在某些區(qū)域發(fā)生聚集的現(xiàn)象，并且其分布存在一定的規(guī)律。這些變化顯示淋巴細(xì)胞激活后細(xì)胞表面積明顯增加，結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜化，顯然是與淋巴細(xì)胞的蛋白分子相繼大量表達(dá)和與外界信息交流增加等免疫生理功能密切相關(guān)的。 在對(duì)淋巴細(xì)胞活化的形態(tài)觀測(cè)的基礎(chǔ)上，使用NSOM，并結(jié)合量子點(diǎn)熒光探針，對(duì)靜息T淋巴細(xì)胞和不同活化時(shí)段的T細(xì)胞的膜蛋白分子CD2、CD3、CD25、CD69進(jìn)行了量子點(diǎn)熒光標(biāo)記和高分辨成像，所得結(jié)果清晰的顯示了這些分子在細(xì)胞表面的分布，以及在不同生理階段的空間和數(shù)量表現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了在分子水平上對(duì)細(xì)胞膜表面分子的數(shù)量化和可視化研究，并對(duì)這些分子之間的空間關(guān)系和時(shí)間關(guān)系進(jìn)行了探測(cè)和初步的探討，發(fā)現(xiàn)隨著活化程度的加深，CD2、CD3等分子出現(xiàn)聚集的現(xiàn)象，這很有可能顯示了淋巴細(xì)胞表面“脂筏”在活化過程中的分子募集現(xiàn)象。并首次發(fā)現(xiàn)CD3和CD69在細(xì)胞表面的定位分布上存在十分緊密的關(guān)系，但其相對(duì)空間位置在不同的活化途徑下有不同的表現(xiàn)，在ConA刺激下CD3和CD69有相同的分布位點(diǎn)，而與CD2，CD25之間在位置分布上則基本沒有規(guī)律可循。 進(jìn)一步結(jié)合偏振熒光成像技術(shù)，對(duì)淋巴細(xì)胞表面的CD3分子的量子點(diǎn)熒光標(biāo)記的空間取向進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同偏振條件下，細(xì)胞表面熒光分子NSOM圖像完全不同，不同取向的熒光位點(diǎn)分布是各不相同的。結(jié)果對(duì)研究這些分子在淋巴細(xì)胞活化和生理功能中的作用等方面提供了一些很有價(jià)值的材料。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

1.2.23淋巴細(xì)胞表面局部的高分辨觀察應(yīng)用AFM對(duì)單個(gè)靜息淋巴和活化后的淋巴細(xì)胞表面的局部和邊緣的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，從圖6中我們可以看到，A為未經(jīng)刺激活化的淋巴細(xì)胞表面的形態(tài)，可見其表面較為均勻，但并非平整光滑，存在一些微小凸起。圖6B、C、D為活化后的淋巴細(xì)胞表面的一些超微結(jié)構(gòu)，從B中可以看到，淋巴細(xì)胞表面出現(xiàn)的凹陷和孔洞，而在圖6C中，可以看到細(xì)胞表面的微小顆粒明顯較未活化前增加，細(xì)胞表面的形態(tài)明顯變得更為復(fù)雜多樣了，而圖6D顯示的則是淋巴細(xì)胞活

圖7A和B分別是2個(gè)經(jīng)過流式細(xì)胞儀篩選出來的未經(jīng)活化處理的T淋巴細(xì)胞，4個(gè)小圖分別為該細(xì)胞的AFM整體形貌圖，截面高度曲線圖，3D模型圖和表面局部超微結(jié)構(gòu)1.2.2.5淋巴細(xì)胞膜骨架的AFM研究初探有別于其他的顯微技術(shù)，AFM是一種以力探測(cè)為原理的儀器，這使它可以作一些不一樣的事情，目前已有許多以熒光標(biāo)記技術(shù)來對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行研究的報(bào)道，在這里我們嘗試不經(jīng)過標(biāo)記，用AFM直接對(duì)淋巴細(xì)胞的骨架進(jìn)行觀察。去垢劑為雙極性分子，可在水中溶解。除膽酸鹽外，去垢劑分子通常是由線性或帶有分枝的碳?xì)浠衔镂膊亢徒Y(jié)構(gòu)各不相同的親水性頭部組成。去垢劑的一個(gè)重要特性就是可以形成分子團(tuán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)膜蛋白與去垢劑分子接觸時(shí)，膜蛋白的疏

娉嚅⒔峁菇鈉辛松縊?上文中的AFM圖像均為敲擊模式下獲得)，在這種掃描模式下，AFM探針始終“壓”在樣品表面。通過接觸模式掃描，獲得了淋巴細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖8所示，從圖中可見，細(xì)胞表面凸現(xiàn)出了一些規(guī)則的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，這與未處理前的淋巴細(xì)胞表面是明顯不一樣的，網(wǎng)格的間距為100nm左右。在經(jīng)過非離子去垢劑處理后，細(xì)胞膜已經(jīng)變得脆弱疏松，在AFM探針的壓迫下，凸現(xiàn)出來的很有可能是對(duì)細(xì)胞膜下的支撐結(jié)構(gòu)，也就是細(xì)胞膜骨架結(jié)構(gòu)。0一田1.的圖8經(jīng)過 Triton一X100處理的淋巴細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu)，膜表面凸現(xiàn)出規(guī)則的網(wǎng)格狀構(gòu)造。掃描范圍ZxZpm

【參考文獻(xiàn)】

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1 鮑幸峰,方積年;原子力顯微鏡在生物大分子結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J];分析化學(xué);2000年10期

2 劉美莉,陳勇,蔡繼業(yè),吳揚(yáng)哲;利用AFM和SNOM對(duì)淋巴細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)及其光學(xué)性質(zhì)的初步研究[J];分子科學(xué)學(xué)報(bào);2005年01期

3 張春陽,馬輝,丁堯,金雷,陳瓞延,苗琦,聶書明;量子點(diǎn)標(biāo)記天花粉蛋白的研究[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào);2001年01期

4 朱星;納米尺度的光學(xué)成像與納米光譜———近場(chǎng)光學(xué)與近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡的進(jìn)展 　[J];物理;1996年08期

5 田芳,李建偉,王琛,汪新文,白春禮;原子力顯微鏡及其對(duì)DNA大分子的應(yīng)用研究[J];物理;1997年04期

6 王靜,唐祖明,顧寧;應(yīng)用原子力顯微術(shù)表征細(xì)胞骨架形貌和測(cè)量中等纖維彈性模量的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào);2003年06期

本文編號(hào)：2782609