【摘要】： 本文主要采用原子力顯微術(shù)(AFM)和近場光學(xué)顯微術(shù)(NSOM)對人外周血淋巴細胞的表面形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)進行了納米級高分辨的成像研究，并結(jié)合量子點探針標記技術(shù)和NSOM成像技術(shù)，對人外周血T淋巴細胞表面的一些膜蛋白分子進行高分辨的熒光成像，突破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微技術(shù)由于衍射極限造成的分辨率限制，實現(xiàn)了直接使用光學(xué)方法對細胞膜表面分子進行原位的分子級的高分辨觀測，對膜表面分子的數(shù)量和定位進行了研究。在此基礎(chǔ)上，對不同生理狀態(tài)下淋巴細胞的形態(tài)和其表面分子的變化進行了觀測。對掃描探針顯微術(shù)在細胞生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進行了一些初步的探討。 主要工作包括應(yīng)用AFM和NSOM，對處于靜息期的單個人外周血淋巴細胞的表面形態(tài)及光學(xué)性質(zhì)進行了觀測，AFM觀測結(jié)果顯示靜息期的單個淋巴細胞基本都呈規(guī)則的球形，表面較為平整，但也存在一些細微突起的結(jié)構(gòu)。NSOM的結(jié)果則顯示了未經(jīng)染色處理的淋巴細胞內(nèi)部豐富的光學(xué)信息，可見到細胞內(nèi)部明確的區(qū)域劃分，以及一些呈現(xiàn)獨特光學(xué)性質(zhì)的區(qū)域，并對不同類型的NSOM成像結(jié)果進行了探討。 在此基礎(chǔ)上，使用AFM和NSOM進一步對活化的淋巴細胞的形態(tài)和熒光性質(zhì)進行了觀測，發(fā)現(xiàn)隨著活化時間的增加，淋巴細胞的形態(tài)發(fā)生明顯的改變，體積明顯變大，細胞表面粗糙度明顯增加，表面微觀結(jié)構(gòu)明顯趨向更為復(fù)雜，并出現(xiàn)一些新的構(gòu)造。NSOM成像的結(jié)果則首次清晰顯示了淋巴細胞活化過程中其自發(fā)熒光的變化，熒光強度呈現(xiàn)逐步加強。熒光的分布則呈現(xiàn)在某些區(qū)域發(fā)生聚集的現(xiàn)象，并且其分布存在一定的規(guī)律。這些變化顯示淋巴細胞激活后細胞表面積明顯增加，結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜化，顯然是與淋巴細胞的蛋白分子相繼大量表達和與外界信息交流增加等免疫生理功能密切相關(guān)的。 在對淋巴細胞活化的形態(tài)觀測的基礎(chǔ)上，使用NSOM，并結(jié)合量子點熒光探針，對靜息T淋巴細胞和不同活化時段的T細胞的膜蛋白分子CD2、CD3、CD25、CD69進行了量子點熒光標記和高分辨成像，所得結(jié)果清晰的顯示了這些分子在細胞表面的分布，以及在不同生理階段的空間和數(shù)量表現(xiàn)，實現(xiàn)了在分子水平上對細胞膜表面分子的數(shù)量化和可視化研究，并對這些分子之間的空間關(guān)系和時間關(guān)系進行了探測和初步的探討，發(fā)現(xiàn)隨著活化程度的加深，CD2、CD3等分子出現(xiàn)聚集的現(xiàn)象，這很有可能顯示了淋巴細胞表面“脂筏”在活化過程中的分子募集現(xiàn)象。并首次發(fā)現(xiàn)CD3和CD69在細胞表面的定位分布上存在十分緊密的關(guān)系，但其相對空間位置在不同的活化途徑下有不同的表現(xiàn)，在ConA刺激下CD3和CD69有相同的分布位點，而與CD2，CD25之間在位置分布上則基本沒有規(guī)律可循。 進一步結(jié)合偏振熒光成像技術(shù)，對淋巴細胞表面的CD3分子的量子點熒光標記的空間取向進行了研究，試驗結(jié)果顯示，在不同偏振條件下，細胞表面熒光分子NSOM圖像完全不同，不同取向的熒光位點分布是各不相同的。結(jié)果對研究這些分子在淋巴細胞活化和生理功能中的作用等方面提供了一些很有價值的材料。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392
【圖文】：

1.2.23淋巴細胞表面局部的高分辨觀察應(yīng)用AFM對單個靜息淋巴和活化后的淋巴細胞表面的局部和邊緣的超微結(jié)構(gòu)進行了分析，從圖6中我們可以看到，A為未經(jīng)刺激活化的淋巴細胞表面的形態(tài)，可見其表面較為均勻，但并非平整光滑，存在一些微小凸起。圖6B、C、D為活化后的淋巴細胞表面的一些超微結(jié)構(gòu)，從B中可以看到，淋巴細胞表面出現(xiàn)的凹陷和孔洞，而在圖6C中，可以看到細胞表面的微小顆粒明顯較未活化前增加，細胞表面的形態(tài)明顯變得更為復(fù)雜多樣了，而圖6D顯示的則是淋巴細胞活

圖7A和B分別是2個經(jīng)過流式細胞儀篩選出來的未經(jīng)活化處理的T淋巴細胞，4個小圖分別為該細胞的AFM整體形貌圖，截面高度曲線圖，3D模型圖和表面局部超微結(jié)構(gòu)1.2.2.5淋巴細胞膜骨架的AFM研究初探有別于其他的顯微技術(shù)，AFM是一種以力探測為原理的儀器，這使它可以作一些不一樣的事情，目前已有許多以熒光標記技術(shù)來對細胞骨架進行研究的報道，在這里我們嘗試不經(jīng)過標記，用AFM直接對淋巴細胞的骨架進行觀察。去垢劑為雙極性分子，可在水中溶解。除膽酸鹽外，去垢劑分子通常是由線性或帶有分枝的碳氫化合物尾部和結(jié)構(gòu)各不相同的親水性頭部組成。去垢劑的一個重要特性就是可以形成分子團結(jié)構(gòu)。當(dāng)膜蛋白與去垢劑分子接觸時，膜蛋白的疏

娉嚅⒔峁菇鈉辛松縊?上文中的AFM圖像均為敲擊模式下獲得)，在這種掃描模式下，AFM探針始終“壓”在樣品表面。通過接觸模式掃描，獲得了淋巴細胞表面的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖8所示，從圖中可見，細胞表面凸現(xiàn)出了一些規(guī)則的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，這與未處理前的淋巴細胞表面是明顯不一樣的，網(wǎng)格的間距為100nm左右。在經(jīng)過非離子去垢劑處理后，細胞膜已經(jīng)變得脆弱疏松，在AFM探針的壓迫下，凸現(xiàn)出來的很有可能是對細胞膜下的支撐結(jié)構(gòu)，也就是細胞膜骨架結(jié)構(gòu)。0一田1.的圖8經(jīng)過 Triton一X100處理的淋巴細胞表面的超微結(jié)構(gòu)，膜表面凸現(xiàn)出規(guī)則的網(wǎng)格狀構(gòu)造。掃描范圍ZxZpm

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2782609