【摘要】：珠蛋白基因的程序性表達(dá)是組織發(fā)育時期專一性的。人的5個β類珠蛋白基因在11號染色體的短臂上形成一簇(ε，~Aγ，~Gγ，δ和β)，并且它們的表達(dá)有兩個主要的開關(guān)，一是從胚胎型(ε)到胎兒型(γ)基因表達(dá)，接著是由胎兒型(γ)到成人型(β)珠蛋白基因表達(dá)。盡管人們已鑒定出許多珠蛋白基因的順式調(diào)控元件及相應(yīng)的反式作用因子，但珠蛋白基因調(diào)控的精確分子機制仍不甚明了，尤其對涉及胎兒及胚胎珠蛋白基因發(fā)育控制的反式作用因子所知有限。 在參與β-類珠蛋白基因調(diào)控的反式作用因子中，具有Cys2-His2型鋅指的Kr(?)ppel樣因子目前研究的較多。其中，人們已經(jīng)對Spl——通用Kr(?)ppel類鋅指蛋白，及EKLF——系組織專一的Kr(?)ppel類鋅指蛋白進(jìn)行了很好的研究。已知Spl與ε、γ及β-珠蛋白基因啟動子CACCC box相互作用；EKLF對β-珠蛋白基因的表達(dá)至關(guān)重要，它結(jié)合在β-珠蛋白基因啟動子的CACCC box上。 近兩年來，又有FKLF和FKLF-2兩個新Kr(?)ppel樣因子相繼被鑒定出來。根據(jù)現(xiàn)有的研究，我們知道FKLF主要由512個氨基酸組成，在近羧基末端有3個鄰近的鋅指，它與Spl、EKLF及KLF家族其他蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)相同。根據(jù)鋅指的氨基酸同源性，F(xiàn)KLF屬于Kr(?)ppel樣因子的第三個亞族。FKLF的特點是在長的氨基末端區(qū)含有兩個酸性及兩個富含脯氨酸的區(qū)域。FKLF主要的轉(zhuǎn)錄活性在氨基端，氨基端的兩個酸性區(qū)構(gòu)成了FKLF反式激活功能的關(guān)鍵區(qū)域。FKLF主要在紅系細(xì)胞中表達(dá)，可能是體內(nèi)胚胎型及胎兒型珠蛋白基因表達(dá)的一個激活因子。目前，國內(nèi)外還沒有對FKLF原核表達(dá)及純化的研究。 本論文通過用PCR方法從pBS/FKLF質(zhì)粒中擴增得到FKLF的編碼序列，將其克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)上，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)后用IPTG誘導(dǎo)，獲得了FKLF融合蛋白的高表達(dá)。再將收集到的包涵體進(jìn)行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳，從膠中分離純化獲得較純的FKLF融合蛋白，經(jīng)純化濃縮后的蛋白濃度約為3.5mg/L培養(yǎng)基。再將獲得的FKLF蛋白免疫新西蘭大耳兔及Balb/C小鼠，制備了FKLF多克隆抗體，效價為1∶800。 同時，我們還構(gòu)建了FKLF的真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-EGFP/FKLF、pcDNA3/FKLF和pIRES-pac/FKLF。實驗結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染有這三個表達(dá)質(zhì)粒的 華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文 K562細(xì)胞中，F(xiàn)KLF的表達(dá)均比空白對照及空載體對照增加明顯。這為進(jìn)一步 研究FKLF對胚胎及胎兒珠蛋白基因表達(dá)的影響奠定了基礎(chǔ)，同時也為進(jìn)一步獲 得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株奠定了基礎(chǔ)。 另外，我們還以K562細(xì)胞和HEL細(xì)胞為模型研究了輕基脈這一胎兒型珠蛋 白的誘導(dǎo)劑對內(nèi)源FKLF表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，輕基脈不能在轉(zhuǎn)錄水平上增加 內(nèi)源FKLF的表達(dá)，而且用FKLF的抗體在翻譯水平上也沒能檢測到FKLF的表 達(dá)。我們推測可能有其它被激活的轉(zhuǎn)錄因子影響了FKLF的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：Q785
【圖文】：

重組質(zhì)粒的限制酶切分析

達(dá)L21(DE3)的染色體上整合了T7RNA聚合酶，在IPTG的誘導(dǎo)下可以高效轉(zhuǎn)錄克表達(dá)條件試驗中，將重組表達(dá)質(zhì)粒pETeoli.BL21(DE3)，同時進(jìn)行IpTG誘導(dǎo)。從，F(xiàn)KLF的表達(dá)并無明顯差異，所以我們5中可以看出，在空載體組及未用IPTG在含有重組質(zhì)粒的菌體經(jīng)1mMIPTG誘達(dá)到最高。經(jīng)SDS一隊GE分析，pET32a(量(一80kD)一致，而空載體表達(dá)菌則2345

圖5.FKLF誘導(dǎo)時間的確定.5.DetenninationoftheinduetiontimeofFK1(DE3產(chǎn)KLF總菌蛋白;2~5為分別經(jīng)lmMIP分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn);6:經(jīng)1mMIPTG誘導(dǎo)sh的空性分析n1MIPTG誘導(dǎo)4h后，表達(dá)產(chǎn)物FKLF淀中，而不存在于裂解上清中(見圖6)。包涵體中，進(jìn)一步的分離純化只須收集包2秘瞬麟彝寒

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 黃淑幀,任兆瑞,陳美玨,許洪平,曾溢滔,G.P.Rodgers,曾凡一,A.N.Schechter;羥基脲(HU)治療β-地中海貧血的研究——HU對珠蛋白基因表達(dá)的影響[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1994年02期

2 桂長云,趙暉,錢若蘭;羥基脲促進(jìn)HEL細(xì)胞分化機制的研究[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報;1999年04期

3 馬曉蕓,王茫桔,瞿祥虎,邢桂春,朱云平,賀福初;堿性Kr

本文編號：2766787