【摘要】：KGF-2、bFGF核轉(zhuǎn)位機(jī)制的初步探討 KGF-2和bFGF同屬成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族，它們都是多效能的細(xì)胞因子，在許多重要的生理過程中發(fā)揮作用。這些過程包括細(xì)胞分化、增殖、血管生成、腫瘤發(fā)生、損傷修復(fù)、胚胎發(fā)育等。目前關(guān)于它們發(fā)揮作用的分子機(jī)制還不是十分清楚，我們根據(jù)分子生物學(xué)原理，結(jié)合基因重組、酵母雙雜交、哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交、細(xì)胞培養(yǎng)等方法對(duì)KGF-2和bFGF相互作用蛋白進(jìn)行了初步研究。研究結(jié)果可概述為以下幾個(gè)方面： 一、采用PCR方法，從人胎肝cDNA文庫中成功釣取了KGF-2和bFGF基因。 二、利用酵母雙雜交系統(tǒng)2篩選KGF-2和bFGF的相互作用蛋白。構(gòu)建KGF-2和bFGF的誘餌蛋白載體pAS2-1-KGF-2和pAS2-1-bFGF并分別轉(zhuǎn)化至酵母宿主Y190，對(duì)KGF-2和bFGF自身的轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明KGF-2和bFGF自身不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。通過對(duì)胎肝cDNA文庫的篩選，得到了2個(gè)與KGF-2存在相互作用的蛋白。序列分析和同源檢索表明：它們分別為未知蛋白PR02605和人核糖體蛋白L22(RPL22)。文獻(xiàn)檢索顯示它們都是新發(fā)現(xiàn)的可能和KGF-2發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)。目前對(duì)RPL22了解較多，它含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是N-結(jié)構(gòu)域、I-結(jié)構(gòu)域和C-結(jié)構(gòu)域，在RPL22的N端有一個(gè)經(jīng)典的核定位信號(hào)。KGF-2與RPL22之間的相互作用可能是其進(jìn)入細(xì)胞核的途徑之一。 三、利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交系統(tǒng)在COS-7細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證了KGF-2與人核糖體蛋白L22間的相互作用。 四、利用外源性KGF-2和bFGF刺激NIH／3T3細(xì)胞，觀察人核糖體蛋白L22基因表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，KGF-2和bFGF作用于細(xì)胞后使RPL22基因表達(dá)水平升高。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：Q78
【圖文】：

OO2.1#陽性AD質(zhì)粒3.2#陽2個(gè)陽性AD質(zhì)粒心了H酶切2陽性對(duì)照3一4陰性對(duì)照1#陽性質(zhì)粒與pASZ一1一KGF一2共2#陽性質(zhì)粒與pASZ一l一KGF一2共陽性質(zhì)粒單轉(zhuǎn)82#陽性質(zhì)粒單51#、2#陽性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活

本實(shí)驗(yàn)利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交系統(tǒng)(Malnlnal1anMATCHMAKERTwo一HybridAssay)和薄層色譜法(Thin一Layerehromatography)在eOS一7細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證KGF一2與候選蛋白之間的相互作用。其基本原理為(圖18):哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交的BD、AD質(zhì)粒分別為pM和pVP16，pM編碼GAL4DNA一BD結(jié)構(gòu)域，pVP一6編碼VP16(單純疤疹病毒VP16蛋白)AD結(jié)構(gòu)域;將KGF一2基因克隆至GAL4BD下游，A.如蛋白質(zhì)X和Y相互作用可激活報(bào)告基因表達(dá)B.如蛋白質(zhì)X和Y不發(fā)生相互作用激活報(bào)告基因不表達(dá)圖18哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交原理示意圖

00DNAMarker2PVP16一l#316一l#，pvP16一2#凡冰I和石妞腸H分析薄層色譜結(jié)果本原理為:如果誘餌蛋白與候選蛋AD彼此靠近而激活報(bào)告基因CA入乙酞CoA和氯霉素，在氯霉素氯霉素。采用薄層色譜即可檢測(cè)到43

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本文編號(hào)：2768061