【摘要】： 瘧疾（malaria）是廣泛流行于熱帶、亞熱帶甚至溫帶邊緣的一種重要 蟲媒傳染病，嚴重地威脅著人類的健康。瘧疾疫情雖然曾得到較好的控 制，但近幾年又有回升趨勢，切實可行的預(yù)防、診斷、治療工作迫在眉 睫。 噬菌體抗體庫技術(shù)為基因工程抗體的研究開辟了新的領(lǐng)域，各種 小分子抗體（特別是人源性小分子抗體）應(yīng)運而生，并在感染性疾病的 診斷與防治、自身免疫性疾病與病毒性疾病的鑒別研究、腫瘤的影像分 析和導(dǎo)向治療或基因治療（細胞內(nèi)免疫）等多個領(lǐng)域展示出巨大的潛能 和廣闊的應(yīng)用前景。該技術(shù)與傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)制備抗體相比，具有簡 單易行、生產(chǎn)成本低、篩選容量大、可通過發(fā)酵大量制備且可繞過細胞 雜交（甚至可不經(jīng)過免疫）等優(yōu)點。 本研究采用噬菌體抗體庫這一新興的生物學(xué)技術(shù)，用HRP-Ⅱ-β 半乳糖苷酶融合蛋白免疫小鼠，取其脾細胞提取mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR 擴增出抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因庫，大小分別為340bp和300bP左右， 純化回收的V_H與V_L在接近等摩爾濃度下，用重疊延伸拼接法以Linker 相連組裝成單鏈抗體基因（ScFv），再用帶限制性內(nèi)切酶位點的引物（5’ 端SfiⅠ，3’端NotⅠ）擴增ScFv基因片段，獲得大小約750bp的目的片 段，純化后分別用SfiⅠ和NotⅠ消化，與SfiⅠ/NotⅠ雙酶切的載體pCANTAB 5E連接，化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化率為3.3×10~6/μg DNA。轉(zhuǎn)化菌經(jīng)輔助噬菌體M13K07援救后，得到庫容約為1.2×10~6的中 等大小的噬菌體抗體庫。經(jīng)質(zhì)粒和PCR初步鑒定，證明有外源片段插入 且其大小與目的片段一致，連接率為60％。 在成功構(gòu)建抗HRP-Ⅱ噬菌體抗體庫的基礎(chǔ)上，我們以HRP-Ⅱ為靶 抗原對噬菌體抗體庫進行了三輪“吸附-擴增-援救”的富集過程，從而 得到了抗HRP-Ⅱ的次級噬菌體抗體庫（滴度為4.2×10~8cfu/ml）。用富 集后的庫液鋪板并挑取單菌落制備噬菌體抗體，分別用HRP-Ⅱ-β半乳 糖苦酶融合蛋白和β-半乳糖苷酶篩選，以單純抗HRP-Ⅱ-β半乳糖苷 第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 酶融合蛋白陽性的克隆為抗HRP－11的陽性克隆，共得到8個陽性克隆 株。選陽性反應(yīng)較強的95號和63號菌株進行抗體的可溶性誘導(dǎo)表達并 作進一步的鑒定，所表達的單鏈抗體分子量大小約為30kD左右，能與 重組HRP－11抗原起特異性免疫反應(yīng)，以培養(yǎng)上清中的抗體活性為最佳。 通過對誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以 OD。；，；；＝0．8、IPTG終濃度 0．2 mM、 誘導(dǎo)溫度30＊、誘導(dǎo)時間20小時為最優(yōu)化條件。以最優(yōu)化條件搖瓶培 養(yǎng)1000 ml制備目的抗體，超濾濃縮后用飽和硫酸鉸分步沉淀法（50％， 70％）加陰離子交換柱分離純化目的抗體，獲得濃度為 0．93ms／L，純度 為42．8％的抗 HRP－11單鏈抗體。測序結(jié)果表明插入片段完全，SJV為 749hp，與理論值相符，DNA及氨基酸序列同源性比較結(jié)果表明，該序列 屬于鼠源抗體SCFV序列，其人及V。分別屬于鼠重鏈可變區(qū)第1亞群 及K鏈第IV亞群。 上述結(jié)果表明，用噬菌體抗體庫技術(shù)制備單鏈抗體簡便、高效，所 獲抗HRP－11單鏈抗體能與靶抗原起特異性免疫反應(yīng)，具有作為免疫診 斷試劑的潛質(zhì)，為基因工程抗體的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：R392-33

【引證文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 何光志;田維毅;高英;王平;王文佳;黃高;蔡琨;安傳偉;;胰腺癌人源噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及初步篩選[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年07期

2 何光志;田維毅;鄧樹軒;高英;李世軍;吳瑪莉;王平;王文佳;奚錦;俞琦;王乾宇;曹峰;黃高;韓潔;蔡琨;安傳偉;;人源抗惡性瘧原蟲單鏈抗體庫的制備及鑒定[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2012年11期

本文編號：2763063