【摘要】：各種原因所致的骨缺損在臨床上十分常見,骨修復(fù)材料需求量巨大,而無論是自體骨,還是人工替代材料都有其固有缺陷,不能滿足臨床的需要,應(yīng)用組織工程技術(shù)有希望為骨缺損治療制備充足的理想骨修復(fù)材料,并展示了良好的臨床應(yīng)用前景。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesenchymal Stem Cells)具有良好的成骨細(xì)胞分化潛能和成骨活性,被認(rèn)為是骨組織工程種子細(xì)胞的最佳選擇之一,而如何快速足量地獲取高質(zhì)量的種子細(xì)胞以及如何定向誘導(dǎo)其成骨分化是骨組織工程學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵。 脈沖電磁場(pulsed electromagnetic fields, PEMFs)臨床用于治療骨不連、骨延遲愈合、假關(guān)節(jié)取得成功,以及特定頻率,特定場強(qiáng)PEMFs能夠刺激成骨細(xì)胞增殖、分化,并可刺激骨局部因子的產(chǎn)生,加速骨基質(zhì)礦化亦已被國內(nèi)外學(xué)者們證實(shí)。然而有關(guān)PEMFs對MSCs成骨的具體生物學(xué)作用研究尚未見報(bào)道,而骨髓MSCs是骨修復(fù)中形成骨的重要前祖細(xì)胞之一,因此我們推測PEMFs刺激很可能對 hMSCs產(chǎn)生一系列生物學(xué)作用,并促進(jìn)骨形成。本課題觀察脈沖電磁場刺激hMSCs體外增殖的作用以及誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的能力,為臨床上體外快速獲取高質(zhì)量hMSCs來源的骨組織工程種子細(xì)胞提供新的技術(shù)手段。研究主要獲得以下結(jié)果: 一、研究脈沖電磁場對人骨髓充質(zhì)干細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。將傳代的第三代hMSCs分為四組:1.常規(guī)傳代培養(yǎng)液組(以下簡稱P-I-); 2.常規(guī)傳代培養(yǎng)液施加脈沖電磁場組(12Hz, 1.1mT, 8h/d) (以下簡稱P+I-); 3.化學(xué)誘導(dǎo)劑(地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C)聯(lián)合常規(guī)傳代培養(yǎng)液組(以下簡稱P-I+); 4.化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合脈沖電磁場(以下簡稱P+I+),應(yīng)用四氮噻唑鹽(MTT)比色法檢測細(xì)胞的增殖,繪制細(xì)胞生長曲線,計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期情況。結(jié)果:化學(xué)誘導(dǎo)培養(yǎng)液組細(xì)胞增殖較常規(guī)傳代培養(yǎng)液組慢,而脈沖電磁場作用后的細(xì)胞增殖能力得到提高,PEMFs刺激后的hMSCs實(shí)驗(yàn)組生長曲線較對照組前移,P-I-組細(xì)胞倍增時(shí)間為33.6h,P+I-組細(xì)胞倍增時(shí)間為29.4h,P-I+組細(xì)胞倍增時(shí)間為36.2h, P+I+組細(xì)胞倍增時(shí)間為34.8h; PEMFs連續(xù)刺激5d后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期:P+I-組細(xì)胞S期細(xì)胞百分比 (20.15 基金項(xiàng)目:國家863計(jì)劃重大專項(xiàng)(2003AA205002);重慶市重點(diǎn)科技攻關(guān)基金資助項(xiàng)目(2003-13-6)。 WP=9 ±2.10) %,同期P-I-組細(xì)胞S期細(xì)胞百分比(8.56±1.13)%,P-I+組細(xì)胞S期細(xì)胞百分比(5.91±0.43)%,P+I+組細(xì)胞S期細(xì)胞百分比(7.73±0.96)%。上述結(jié)果提示PEMFs對hMSCs的生物學(xué)效應(yīng)一個(gè)重要方面表現(xiàn)在PEMFs能夠顯著促進(jìn)hMSCs細(xì)胞增殖,DNA合成加速(p0.01)。 二、觀察脈沖電磁場誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響。將傳代的第三代hMSCs予以常規(guī)傳代培養(yǎng)液培養(yǎng),施加脈沖電磁場(12Hz, 1.1mT, 8h/d),應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、堿性磷酸酶染色、骨鈣素免疫組化染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色、核固紅鈣染色、Von Kossa鈣染色、四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記以及放免法測定骨鈣素的分泌情況和堿性磷酸酶(ALP)活性的測定。結(jié)果:經(jīng)PEMFs刺激4d～ 5d后, hMSCs細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,2 周形成多層結(jié)構(gòu) ,3周左右聚集成細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)。透射電鏡觀察提示:細(xì)胞成熟,核漿比例小,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,細(xì)胞堿性磷酸酶染色、骨鈣素免疫組化染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色、核固紅鈣染色、Von Kossa鈣染色、四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記均陽性。而常規(guī)傳代培養(yǎng)液組hMSCs隨培養(yǎng)時(shí)間延長并未出現(xiàn)細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié),同期透射電鏡觀察提示為幼稚細(xì)胞,核漿比例大,細(xì)胞堿性磷酸酶染色、骨鈣素免疫組化染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色均陰性;PEMFs刺激hMSCs后能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的骨鈣素分泌,隨刺激時(shí)間延長,骨鈣素活性增高更加明顯,而常規(guī)傳代培養(yǎng)液組hMSCs未檢測到骨鈣素的分泌,同樣PEMFs刺激組hMSCs的ALP活性亦顯著增高,刺激4天后即可見ALP顯著增高,隨刺激時(shí)間延長,ALP活性增高更加明顯,12天達(dá)到高峰,14天時(shí)略有下降,仍高于對照組水平。ALP活性第6天所測結(jié)果為;P+I-組為0.42±0.02金氏單位/100ml,P-I+組為0.47±0.03金氏單位/100ml,P+I+組為1.12±0.11金氏單位/100ml,而P-I-組僅為0.02±0.01金氏單位/100ml,上述結(jié)果提示:人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)合理的脈沖電磁場體外刺激后,能夠明顯促進(jìn)hMSCs成骨分化(p0.01),符合成骨細(xì)胞的形態(tài)特征和生物學(xué)特性,可為體外構(gòu)建組織工程化骨提供自體種子細(xì)胞。 綜上所述,我們可以得出結(jié)論:脈沖電磁場能夠促進(jìn)其增殖,縮短細(xì)胞倍增時(shí)間,生長曲線前移;脈沖電磁場能夠誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化,表達(dá)堿性磷酸酶、骨鈣素、Ⅰ型膠原,促進(jìn)其骨礦化,適合作為骨組織工程的種子細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R329.2
【圖文】：

051015202530S G2+M+S細(xì)胞周期分率（％）百P-I-P+I-P-I+P+I+第三代 hMSCs 在 P-I-、P+I-、P-I+、P+I+培養(yǎng)條件下第 5d 所測細(xì)胞周期

流式細(xì)胞儀檢測第三代hMSCs在P＋I(xiàn)－培養(yǎng)條件下的第5d細(xì)胞周期

流式細(xì)胞儀檢測第三代hMSCs在P－I＋培養(yǎng)條件下的第5d細(xì)胞周期

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本文編號：2761064