【摘要】：目的：構(gòu)建結(jié)核分支桿菌分泌蛋白Ag85A、Ag85B編碼基因的DNA疫苗，研究這兩種DNA疫苗的免疫原性和保護(hù)效力。 方法：用PCR的方法擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌Ag85A、Ag85B編碼基因，然后與真核表達(dá)載體pVAX1重組，構(gòu)建的DNA疫苗經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定后，應(yīng)用Qiagen試劑盒大量純化無內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA。將C57BL／6小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別用生理鹽水(A)、載體質(zhì)粒(B)、Ag85A DNA疫苗(D)、Ag85B DNA疫苗(E)通過肌肉注射的方法免疫小鼠，每3周免疫1次，共免疫3次；卡介苗(C)組每只小鼠腹部皮內(nèi)注射，只免疫一次。通過ELISA方法檢測血清中抗Ag85A、Ag85B抗體及其亞型。上述5組小鼠各取6只，第三次免疫后28天用結(jié)核分支桿菌H37Rv攻擊，觀察小鼠體重變化，攻擊4周后檢測細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12，進(jìn)行肺組織病理檢查及菌落計(jì)數(shù)等。 結(jié)果：重組質(zhì)粒Ag85A-pVAX1和Ag85B-pVAX1 DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增分別可見1041bp Ag85A和978bp Ag85B特異性片段；經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ消化后也可見1041bp或978bp特異性片段；測序結(jié)果也表明成功地構(gòu)建了Ag85A和Ag85B DNA疫苗。經(jīng)Ag85A和Ag85B DNA疫苗免疫的小鼠特異性抗體IgG均顯著高于對(duì)照組，而且IgG2b均高于IgG1和IgG2a。結(jié)核分支桿菌攻擊后各組小鼠體重變化呈現(xiàn)不同趨勢，A、B組小鼠體重從第3周開始下降；C組體重除第3周較前一周略有下降外，總體呈上升趨勢；D組在第4周開始下降；E組體重第2周開始下降，之后維持不變。MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中D、E組的刺激指數(shù)顯著高于其它組；D、E組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率也顯著高于A、B組。肺組織菌落計(jì)數(shù)C組最低，其次是E、D組。大體病理結(jié)果顯示C組和D組肺組織病變較A、B、E組輕。A和E組中各有2只，B組中有3只肺部有病變，充血較明顯，組織有捻發(fā)感。小鼠肺組織切片鏡下觀察顯示：A組小鼠約70～80％的肺泡腔內(nèi)有大量滲出液，肺泡壁充血、水腫，小血管周圍有少量淋巴細(xì)胞浸潤，未見典型肉芽腫形成。B組肺泡壁腫脹、增厚、有少量淋巴細(xì)胞聚集，少數(shù)肺泡腔內(nèi)充滿滲出液，部分肺泡腔消失，未見典型肉芽腫形成。C組肺泡壁增厚，可見大量 淋巴細(xì)胞聚集，并有肉芽腫形成，導(dǎo)致部分肺泡腔消失，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出液。 D組肺泡壁增厚，可見淋巴細(xì)胞聚集和肉芽腫形成，與C組類似，但肉芽腫數(shù)目 比C組少，表現(xiàn)為增殖為主的病變。E組肺泡壁充血、增厚，部分肺泡腔萎陷， 肺泡腔內(nèi)滲出液不明顯，可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，未見典型肉芽腫形成。各組小 鼠未見干酪樣壞死。 結(jié)論:Ag85A、Ag85B DNA疫苗都具有較強(qiáng)的免疫原性，呈THI型細(xì)胞介導(dǎo) 的免疫應(yīng)答; Ag85A DNA疫苗的免疫保護(hù)效力比Ag85B DNA疫苗強(qiáng)，但均不如 BCG，有待進(jìn)一步研究其應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

用Qiagen試劑盒大量提取載體質(zhì)粒和重組質(zhì)粒Ag85A、Ag85B，純化過程中留取的洗脫液樣品經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳顯示，純化的DNA樣品無RNA污染(見圖3)每次制備的DNA樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定OD260n耐OD280nm均為1.8左右(見圖4，5，6)DNA純度高，不含RNA和蛋白。以生理鹽水注射液調(diào)整三種質(zhì)粒DNA濃度為lm留ml。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2760323