發(fā)布時間：2020-07-14 04:37

【摘要】：目的:提取健康人外周血淋巴細胞的mRNA,利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法,建立一個大容量的人抗體Fab段的天然抗體庫。方法:收集健康者外周血,提取淋巴細胞,以淋巴細胞mRNA為模板,擴增人抗體Fab段,連入載體pComb3內(nèi),利用電轉(zhuǎn)化的方法,構(gòu)建噬菌體抗體庫。結(jié)果:最終建立了重鏈庫為1.73×107,輕鏈庫為8.52×104的天然抗體庫,并利用酶切鑒定計算出實際庫容為重鏈庫1.21×107,輕鏈庫4.26×104,所以理論上所建天然噬菌體抗體庫總的庫容量可以達到5.15×1011。結(jié)論:成功構(gòu)建了一個大容量的完全人源化的天然抗體庫。
【圖文】：

2　結(jié)果2. 1　Fd段、κ鏈、λ鏈PCR擴增結(jié)果　將獲得mRNA全部反轉(zhuǎn)錄,所得cDNA為模板進行PCR,結(jié)果如圖1所示。圖1　Fd段、κ鏈、λ鏈PCR擴增結(jié)果1: Fd段PCR產(chǎn)物; 2:κ鏈PCR產(chǎn)物; 3:λ鏈PCR產(chǎn)物; M: DNAmarkers.2.2　抗體庫的建立　將連接產(chǎn)物進行電轉(zhuǎn)化,將轉(zhuǎn)化后菌液涂布氨芐青霉素平板, Fd庫以1/1 0000的比例涂板,輕鏈庫以1/100的比例涂板,計數(shù)平板上的菌落,假設一個菌落為一種抗體,計算轉(zhuǎn)化率。最終建立重鏈庫1. 73×107,輕鏈庫8. 52×104。這樣

抗體庫進行了鑒定。將抗體庫取10μL, 100倍稀釋,涂布平板,挑取單個克隆,搖菌過夜,提取質(zhì)粒,做酶切鑒定。每個庫隨機挑取10個單克隆(圖2)。從圖2可以看出,重鏈庫中有70%正確克隆,所以實際的庫容量為1. 21×107。輕鏈庫中有50%正確克隆,所以實際庫容量為4. 26×104。實際的總庫容量為5. 15×1011。圖2　Fd段庫、輕鏈庫酶切鑒定1-10: Fd段庫酶切鑒定; 11-20:輕鏈庫酶切鑒定; M: DNAmarkers.3　討論要構(gòu)建大庫容量的抗體庫,淋巴細胞的量至少要達到107以上,因為人類天然抗體庫的重鏈即有107的多樣性。只有淋巴細胞的量達到這個數(shù)量級,才有可能將每一種抗體基因都擴增出來。本研究從1 150mL的外周血分離的淋巴細胞共計約2. 3×109,這為成功地構(gòu)建大庫容量的抗體庫提供了基本的保證。為了盡可能全面的擴增出抗體家族的各成員的抗體片段

【相似文獻】

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