發(fā)布時(shí)間：2020-07-12 15:07

【摘要】：目的 構(gòu)建含CMV啟動(dòng)子、pp65全長(zhǎng)和分泌肽的PcDNA5.0轉(zhuǎn)染載體(即HCMV粗制基因疫苗)，轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞，建立HCMV pp65蛋白的高效表達(dá)系統(tǒng)，為研制HCMV基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。方法 將HCMV AD169株感染W(wǎng)I-38細(xì)胞，收集上清作為實(shí)驗(yàn)用的模板，應(yīng)用PCR法擴(kuò)增pp65全長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化到pUC118HincⅡ／BAP質(zhì)粒載體，測(cè)序；構(gòu)建自制的含CMV啟動(dòng)子、pp65和分泌肽基因的PcDNA5.0轉(zhuǎn)染載體，即擴(kuò)增含CMV啟動(dòng)子及其上下游序列，克隆測(cè)序作為新的CMV啟動(dòng)子，人工合成小鼠IgK鏈分泌肽與pp65基因進(jìn)行酶切、連接，應(yīng)用交換引物的PCR法鑒定。同時(shí)應(yīng)用脂質(zhì)體法將該載體轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞，加入潮霉素進(jìn)行篩選，收集CHO細(xì)胞的上清液進(jìn)行純化，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳(考馬斯亮藍(lán)染色)、Westen-bloting和Western-ECL system斑點(diǎn)雜交鑒定pp65蛋白。結(jié)果 1．克隆pp65全長(zhǎng)在TaKaRa Biotech公司測(cè)序結(jié)果與Medline上HCMV AD169株上的pp65標(biāo)準(zhǔn)序列比較：一致性為99.94％，僅在第1455個(gè)堿基有差異，由密碼子CCG突變?yōu)镃CA。2．成功構(gòu)建了含有分泌肽、CMV啟動(dòng)子(含有增強(qiáng)子和內(nèi)含子)和pp65全長(zhǎng)PcDNA5.0的轉(zhuǎn)染載體，應(yīng)用交換引物的PCR法鑒定和CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染的結(jié)果證實(shí)：構(gòu)建PcDNA5.0的轉(zhuǎn)染載體成功。3．載體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞后，在上清中收集的表達(dá)蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電 安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 泳、western一EeL system斑點(diǎn)雜交和westen一bloting鑒定為純化的pp65蛋 白，可作為HCMV亞單位疫苗研制的主要蛋白抗原。結(jié)論1成功地完成J’ pp65全長(zhǎng)的基因克隆。2.構(gòu)建了含有分泌膚、CMV啟動(dòng)子和pp65cDNA的 pcDNAS.o真核載體(即粗制的HCMV基因疫苗)。3.PP65蛋白在CHO鄉(xiāng)l} 胞成功地表達(dá)，為研制HCMV基因_I_程亞單位疫苗提供了病毒蛋白的抗原
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 朱一冰,潘世模;巨細(xì)胞病毒宮內(nèi)感染對(duì)新生兒心肌的影響[J];新生兒科雜志;2001年05期

2 宋海靜,谷志遠(yuǎn),盧彥平;原位PCR技術(shù)檢測(cè)石蠟包埋腦組織中人巨細(xì)胞病毒DNA[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1997年06期

本文編號(hào)：2752131