【摘要】： 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA)是一種最常見的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，也是國際上公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物，于1965年首次在人結(jié)腸癌和胰腺癌中發(fā)現(xiàn)，1987年克隆出它的全長基因序列。它是一種分子量約為180kd的糖蛋白分子，胚胎時(shí)期可正常表達(dá)分泌，并對(duì)胚胎的發(fā)育、組織形成及發(fā)展具有重要的作用。成年后，CEA的表達(dá)消失，但在胃腸道惡性腫瘤、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌等癌細(xì)胞表面又可重新表達(dá)CEA，所以在成年人體內(nèi)，CEA可作為腫瘤檢測和治療的靶分子。上述腫瘤細(xì)胞表面雖有CEA分子，但并不能激起機(jī)體針對(duì)CEA的特異性免疫應(yīng)答，所以這些腫瘤細(xì)胞能逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，發(fā)展成腫瘤。 九十年代初，一種新型的疫苗-DNA疫苗的出現(xiàn)為解決CEA的免疫原性，打破機(jī)體免疫耐受提供了新的途徑，同時(shí)也為CEA陽性腫瘤的治療提供了新方法。核酸疫苗是指將含有編碼腫瘤相關(guān)抗原基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，直接接種到動(dòng)物體內(nèi)，然后被動(dòng)物細(xì)胞攝取并表達(dá)出相應(yīng)的抗原，通過不同途徑刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答，從而消除或抑制腫瘤細(xì)胞的生長。1994年，Conry 鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院2002研究生畢業(yè)論文 癌胚抗原＊＊A疫苗構(gòu)建及佐劑對(duì)其兔疫效應(yīng)的影響 就構(gòu)建了 CEA DNA疫苗，并在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了良好的兔疫效 果。學(xué)者們?yōu)榱嗽鰪?qiáng)DNA疫苗的免疫效果，主要采取以下措施： 1．免疫局部處理；2．應(yīng)用高效、安全的表達(dá)載體；3．在DNA免 疫中引入細(xì)胞因子或粘附分子；4．在疫苗中引入免疫刺激序列。 本文運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建了CEA的DNA疫苗PC工Cn，白細(xì) 胞介素七的真核表達(dá)質(zhì)粒PCI可L《，設(shè)計(jì)合成了硫代修飾的免 疫刺激序列門SS），希望從載體、細(xì)胞因子和ES方面提高 CEA 的表達(dá)和抗｛EA的產(chǎn)生，從而達(dá)到對(duì)優(yōu)A陽性腫瘤免疫防治的目 的。 材料和方法： 1．PCI｛n的構(gòu)建制備和定量：ECORI酶切含仍A全基因的質(zhì)粒 pGEM。－CEA，瓊脂糖電泳回收2．4kb的片段，與經(jīng)ECORI 酶切的 真核表達(dá)質(zhì)粒 pCI丁eo在 T4連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化 DHS u菌， KR法篩選重組質(zhì)粒，然后經(jīng)＊ajnH工、Bg1H不對(duì)稱酶切鑒定 2．4kb片段正確插入，命名為 pCI－CEA。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DHS u， 大量培養(yǎng)后，堿裂解法提取質(zhì)粒，聚乙二醇法純化，紫外分光 光度法測量DNA純度并定量。 2．PCI－IL－2的構(gòu)建：用oligo 軟件設(shè)計(jì)弓物，在上、下游引物的 5’端加上Xhol和 Sail酶切位點(diǎn)，以便于與載體連接。PCR法 擴(kuò)增幾億片段，在T4連接酶的作用下與 Xhol和 Sal工酶切的 pCI－neo載體連接，PCR法鑒定重組體，用 Xho工，Xhol＋Sal， Ban工工酶切進(jìn)一步驗(yàn)證重組體，命名為pCllL－2。 3．DM免疫：對(duì)0．＊％的布比卡因注射入Mn幾小鼠勝前肌，在 ＿2＿ 鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院2002研究生畢業(yè)論文 癌胚抗原＊＊A疫苗構(gòu)建及佐劑對(duì)其兔疫效應(yīng)的影響 注射后第 3大分別接種濃度為 in g／ul的 CEA DNA疫苗及相應(yīng) 佐劑口SS或 gIL《廠每側(cè) 50 u g，每組 5只小鼠，對(duì)照組注射 50 yi的PBS緩沖液。然后在第10、24大分別再免疫兩次。 4．CEA DNA疫苗在體內(nèi)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗｛EA及 CEA的表達(dá)：于 DNA疫苗末次免疫后第1、2、4、6周分別采集小鼠血液以ELISA 方法檢測小鼠血清中抗｛EA和 CEA。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS10．0軟件 分析比較其差異顯著性。 結(jié)果： 1．構(gòu)建的 pCI－CEA，經(jīng)ECORI酶切后獲得2．4kb和 5．4kb的片段， 經(jīng) BalnHI 酶切后獲得 3．okb和 4．skb片段，經(jīng) Bglll 酶切后獲 得0．4kb和 7．4kb片段，與理論值一致。 2．構(gòu)建的pCI－IL－2，經(jīng)PCR擴(kuò)增陽性，經(jīng)XhOI酶切后獲得6．Zkb 的片段，經(jīng) Xho工和 Sail酶切后獲得 0．skb和 5．4kb片段，經(jīng) Banff酶切后獲得 0．gkb．1．3kb和 3．Zkb片段，證明是所要構(gòu) 建的質(zhì)粒。 3．DNA免疫后，CEA的表達(dá)：pCI－CEA組明顯高于 pcDNA。－CEA組， 檢驗(yàn)差異有顯著性。PC工－IL－2和 ISS未能增加 CEA的表達(dá)。 4．抗－CEA的產(chǎn)生：pCI－CEA組高于pCDNA。－CEA組，檢驗(yàn)差異有顯 著性。ISS和白細(xì)胞介素－2質(zhì)粒（PIL－2）均能增強(qiáng)抗－CEA分泌。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：載體、細(xì)胞因子和 ISS能增加 DNA疫苗的免 疫效果，但如何增加 DNA疫苗的抗原表達(dá)量仍需探討更為有效的 方法。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步提高 CEA DNA疫苗的免疫效果、作用機(jī)制 及影響因素提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步研究DNA免疫提供了參考。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 魏林,戴建新,孫樹漢;人癌胚抗原與新城疫病毒HN基因共表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];生物工程學(xué)報(bào);2000年05期

本文編號(hào)：2747576