【摘要】：目的: 采用基因工程技術(shù)獲得高效表達(dá)的重組幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,H.pylori）中性粒細(xì)胞激活蛋白Nap,為研制H.pylori疫苗提供有效抗原，為探討Nap致病機(jī)理、檢測(cè)H.pylori感染患者血清Nap抗體提供材料。 方法：用PCR從Helicobacter pylori 臨床分離株DNA中擴(kuò)增出目的基因napA，定向插入原核表達(dá)載體pQE30中，測(cè)序分析確認(rèn)后，轉(zhuǎn)化表達(dá)受體菌DH5a， SDS-PAGE分析表達(dá)情況，Western blot檢測(cè)其抗原性。Ni2+-NTA樹脂純化后，用重組蛋白免疫兔,鑒定其免疫原性。并以純化的重組蛋白為抗原，建立檢測(cè)血清Nap抗體的間接ELISA法，對(duì)H.pylori患者血清進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果： 1.PCR擴(kuò)增出435bp目的基因片段napA，克隆入pQE30質(zhì)粒。序列分析所得序列完整，與Genbank中的H.pylori菌株相比有高度同源性，與文獻(xiàn)報(bào)道的中國(guó)菌株相比同源性達(dá)97.4%；2.工程菌誘導(dǎo)后SDS-PAGE顯示新生蛋白帶，相對(duì)分子量為17×103，與預(yù)期一致，約占菌體總蛋白的38.8%；3.Western blot顯示重組蛋白可被H.pylori感染患者陽性混合血清所識(shí)別；4.SDS-PAGE分析 WP=7 表明目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)NI2＋-NTA柱純化，可獲得純度為92.5%重組蛋白；5.純化蛋白免疫兔后，所得免疫血清可與H.pylori全菌抗原發(fā)生反應(yīng)，具有良好的免疫原性 ；6.用重組蛋白建立檢測(cè)血清Nap抗體的間接ELISA法，敏感性與特異性分別是86.7%和100%�！� 結(jié)論：H.pylori napA基因原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，并在大腸桿菌中高效表達(dá)，重組蛋白具有良好的抗原性與免疫原性，經(jīng)NI2＋-NTA柱純化可獲得高純度的目的蛋白，為進(jìn)一步制備H.pylori疫苗提供了有效的候選抗原，此抗原可用于H.pylori感染患者血清Nap抗體的檢測(cè)和致病機(jī)理的研究。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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