【摘要】： 背景：CD8~+效應(yīng)T淋巴細(xì)胞(CD8~+CTL)介導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)在機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。但腫瘤抗原特異性CD8~+CTL數(shù)量上的擴(kuò)增和特異性腫瘤殺傷活性的激發(fā)必須有CD4~+ T淋巴細(xì)胞的輔助與成熟的樹突狀細(xì)胞(mDC)對(duì)腫瘤抗原的有效遞呈。CD154／CD40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是介導(dǎo)CD4~+T淋巴細(xì)胞的輔助作用與誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞完全成熟并獲得抗原遞呈與免疫刺激能力的重要途徑。CD154(CD40L，TRAP，gp39)屬于TNF基因家族成員，是一個(gè)由261個(gè)氨基酸組成的Ⅱ型跨膜糖蛋白，分子量33kDa，主要瞬時(shí)表達(dá)于人活化的CD4~+T淋巴細(xì)胞、部分活化的CD8~+T淋巴細(xì)胞和γ δT淋巴細(xì)胞表面，是參與機(jī)體特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的重要免疫共刺激分子。CD154蛋白的受體CD40分子是一個(gè)由277個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量48kDa，屬于TNF受體超家族成員，CD40分子分布于B細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)、濾泡樹突狀細(xì)胞(follicular dendritic cell，F(xiàn)DC)、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血干／祖細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞表面。CD40／CD154相互作用不僅介導(dǎo)B細(xì)胞活化、增殖、分化、抗體產(chǎn)生與Ig類型轉(zhuǎn)換，而且CD4~+T淋巴細(xì)胞、DC、CD8~+T淋巴細(xì)胞間CD40分子與CD154分子介導(dǎo)的雙向信號(hào)流動(dòng)是調(diào)控T淋巴細(xì)胞與DC活化、增殖，啟動(dòng)并維持機(jī)體特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)以及建立機(jī)體CTL記憶效應(yīng)的關(guān)鍵性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。CD40／CD154信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在DC發(fā)育成熟及發(fā)揮抗原遞呈、免疫激活功能中的作用主要表現(xiàn)在：(1)促進(jìn)DC增殖、分化與成熟，上調(diào)未成熟DC細(xì)胞表面CD83、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD54(ICAM-1)、CD58(LFA-3)等免疫輔助分子的表達(dá)。 鄭州大學(xué)2003屆碩士學(xué)位論文 人CD154基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在Ecal09細(xì)胞中的表達(dá) (2)促進(jìn)DC從外周向淋巴結(jié)遷移及DC在淋巴結(jié)內(nèi)存活，增加淋巴結(jié)內(nèi)遞呈抗原 的成熟DC的數(shù)量，延長DC有效遞呈抗原的時(shí)間。(3)增加DC IL一12的分泌量， 誘導(dǎo)較強(qiáng)的Thl類反應(yīng)及細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。(4)增加DC分泌促炎癥性細(xì)胞因 子IL一lp，IL一6，IFN一Y，TNF一a，進(jìn)一步促進(jìn)DC的成熟活化與免疫刺激功能。(5)上 調(diào)DC表達(dá)對(duì)T細(xì)胞活化、增殖存活具有重要作用的分子OXCD40L，4一1 BBL和 eo27L(en7o)，成熟nC表達(dá)的oXCD40L與表達(dá)在激活的CD4‘T淋巴細(xì)胞和激活 的CDS‘T淋巴細(xì)胞表面的OXCD40相互作用，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞與DC的活化和分化， 促進(jìn)IL一12合成增多。4一IBBL/4一IBB共刺激信號(hào)協(xié)同B7/ CD28共刺激信號(hào)作用， 抑制成熟T淋巴細(xì)胞AICD(aetivation indueed Cell death)的發(fā)生。4一IBBL和 CD27L不僅向增生的CDS+T淋巴細(xì)胞提供關(guān)鍵性的存活信號(hào)，促進(jìn)CTL殺傷效應(yīng) 的發(fā)揮，而且在維持cTL免疫記憶中起重要作用。(6)CD154/CD40結(jié)合激活DC后 分泌的細(xì)胞因子和趨化因子如IL一lp，IL一8，IL一12，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白一IY (maCrophage inflammatory protein一Iy，MIP一IY)等促進(jìn)抗原特異性的eDS+eTL 克隆性擴(kuò)增及在外周血、淋巴結(jié)、脾臟的分布，增加腫瘤部位CDS+CTL浸潤、富 集。(7)經(jīng)CD 1 54/CD40結(jié)合激活的DC能夠拮抗腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞分泌的抑 制性細(xì)胞因子如IL一10的阻抑作用。(8)表面MHC分子結(jié)合有抗原的DC經(jīng) CD154/CD40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激發(fā)后不需CD曠T淋巴細(xì)胞輔助，直接激活CDS+T淋巴細(xì) 胞產(chǎn)生針對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷作用。CD4O+腫瘤細(xì)胞表面的CD40分子被CD154 分子結(jié)合后因腫瘤細(xì)胞組織來源不同，去分化程度差異及CD40分子表達(dá)的細(xì)胞膜 表面分子背景不同而產(chǎn)生截然相反的效應(yīng)。在低分級(jí)(低度惡性)B細(xì)胞惡性腫瘤、 霍奇金氏病、HIV相關(guān)淋巴瘤、膀膚癌上CD40分子被CD154分子結(jié)合傳遞抗凋亡 信號(hào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活與增殖。對(duì)卵巢癌、宮頸癌、惡性黑色素瘤、喉癌等腫瘤 的研究顯示這些腫瘤細(xì)胞膜上的CD40分子被CD154分子結(jié)合引起細(xì)胞周期停滯在 GZ一M期，且可增強(qiáng)刺激物如細(xì)胞毒藥物順鉑、TNF一a、抗Fas和神經(jīng)酞胺誘導(dǎo)的 凋亡。CD154分子在肝癌、多發(fā)性骨髓瘤上與CD40分子結(jié)合后導(dǎo)致相反的效應(yīng)， 可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，也可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡。利用轉(zhuǎn)染CD154基因的腫瘤細(xì)胞 及重組CD154分子進(jìn)行腫瘤免疫治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床I期研究結(jié)果鼓舞人心，顯 示了誘人的臨床應(yīng)用前景。 目的:獲得人cD154基因真核表達(dá)載體peDNA3.1一cD154與穩(wěn)定表達(dá)重組 鄭州人學(xué)2003屆碩士學(xué)位論文 人＊m 54補(bǔ)月真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在優(yōu)。川9細(xì)胞中的表達(dá) CD154分子的食管癌細(xì)胞株Ecal09，初步觀察轉(zhuǎn)染CD154基因后Eca109細(xì)胞的細(xì) 胞生物學(xué)特性。 方法：應(yīng)用淋巴細(xì)胞分層液密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，體外經(jīng) PHA激活 8 ’J’時(shí)后提取總 RNA，利用 RT－PCR和巢式 PCR技術(shù)擴(kuò)增人 CD154 cDNA 全長，用 T－A克隆的方法構(gòu)建克隆載體 pUC18（D154質(zhì)粒，采用 BamH單酶切從 pUC18（ 質(zhì)粒上切下 CD154 CDNA全長后同去磷酸化的 BamH單酶切 pCDNA3．l質(zhì)粒亞克隆構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3．ICD154，用質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)上游 的T7通用引物與巢式PCR內(nèi)下引物PCR擴(kuò)增一步鑒定CD154 CDNA正向插入的 重組質(zhì)粒 PcDNA3．ICD154
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2746839