【摘要】：人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)與宮頸癌的密切關(guān)系已經(jīng)證明預(yù)防性疫苗可以減少在全世界范圍由HPV感染的發(fā)生。無(wú)感染性的HPV L1蛋白可以自發(fā)組裝成病毒樣顆粒(virus-likeparticle，VLP)，是目前預(yù)防HPV感染和子宮頸癌很好的候選疫苗。由于50％的宮頸癌與HPV16感染相關(guān)，所以用這一型作為疫苗，可以減少HPV感染年輕婦女的死亡率。Ⅲ期臨床試驗(yàn)表明，HPV16的VLP疫苗在保護(hù)HPV16感染的有效性可達(dá)到91％。目前，HPV16 L1疫苗主要在酵母菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞和原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和純化，但其昂貴的生產(chǎn)工藝阻礙其廣泛應(yīng)用。本文使用酵母表達(dá)系統(tǒng)和乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)首次將表達(dá)的HPV16 L1蛋白分泌并錨定在細(xì)胞膜的表面，與菌體一起用藥，無(wú)需純化，廉價(jià)安全。本文主要有三方面內(nèi)容： 一、HPV16 L1蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá) 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到酶切位點(diǎn)修飾的HPV16 L1片段，克隆到T-easy載體，測(cè)序正確后以Kpn1和Xho1酶切回收目的片段，然后連接到pET32a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后表達(dá)，SDS-PAGE電泳鑒定，其表達(dá)形式以包涵體為主，并采用親和層析初步建立了HPV16 L1蛋白純化工藝。ELISA、Western Blot鑒定結(jié)果表明，融合蛋白Trx-HPV16 L1能夠識(shí)別并結(jié)合HPV16 L1單抗，而單獨(dú)的Trx蛋白與HPV16 L1單克隆抗體不具有親和活性，表明融合蛋白與 HPV16U單抗結(jié)合是特異的，所以可將純化的蛋白HPV16 Ll作為 檢測(cè)酵母菌EBYI儀I/PYD 1.HPV16LI、乳桿菌89(為壓SCinAE書(shū)rV16LI 通過(guò)灌胃、滴鼻、皮下注射等途徑免疫小鼠產(chǎn)生HPv16LI抗體的抗 原。 二、表達(dá)載體PYDI.HPV16LI的構(gòu)建和HPV16U蛋白在酵母菌 EBYloo膜表面的表達(dá) 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到酶切位點(diǎn)修飾的HPV16 Ll片段，克隆 到T一easy載體，測(cè)序正確后以KPnl和腸o1酶切回收目的片段， 然后連接到PYDI表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母菌EBY100后表達(dá)，EUSA、 IFA鑒定繕果表明蛋白與HPv16LI單抗的結(jié)合是特異的，皿結(jié)果 表明表達(dá)的蛋白被分泌到酵母菌外并錨定在膜的表面。 三、表達(dá)載體PSCn1AE一PV16LI的構(gòu)建和HPV16LI蛋白在德 氏乳桿菌8909膜表面的表達(dá) 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到酶切位點(diǎn)修飾的HPV16 Ll片段，克隆 到T一easy載體，測(cè)序正確后以Sfil和Ascl酶切回收目的片段，然 后連接到PSCnl AE表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化德氏乳桿菌8909后表達(dá)， EUSA、Westem Bfot鑒定結(jié)果表明，蛋白與HPV16 Ll單抗的結(jié)合 是特異的。 總之，我們已成功的在酵母菌EBYIOO和乳桿菌DM8909的細(xì)胞 表面表達(dá)HPv16LI蛋白，如果疫苗免疫小鼠證明有效，就可為疫苗的 發(fā)展提供新的途徑。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R392.1
【圖文】：

1.2HPV16型Ll基因的PCR擴(kuò)增以PUC16服Pv16Ll質(zhì)粒為模板進(jìn)行PcR擴(kuò)增，獲得一條分子大小約為1.skb的人乳頭瘤病毒16型Ll基因片段(圖2一1)。12繃哪繃劍100卜卜卜卜1.HPV16LIPCRfra卯坦ni2.DLZ，000Marker圖2一1HPv16LI基因片段的PCR擴(kuò)增Fig.2一1PCRarnP肪eationofHPV16LI

5(X)0Marker2.DLZ，000Marker3.KPnl+X上。1山羅stion4.PCRalnPification5.PET32a(+娜PV16LIPlas面d圖2一3pEr32a(+)壓Jv16LI的酶切鑒定圖譜Fig.2一3RestriClionanylysisofrecombinaniPlasrnidofP盯32a(+)舊PV16LlA:1234SB:1234jjj97KD66KD叫卜97KD礴一66KD叫卜-47KD47KD31KDee書(shū)呀一31KDA:1.Pro.einMar址rZ，3.竹籠一HPV16L14，5.P曰32a(+)conirolB:l，2.h喊pitate3.ProteinMar址r4.乳拌n.tani圖2一5pEr32a(+)居任v16LI在Ecoli中表達(dá)的sDs

3.1包涵體的洗滌將包涵體用Zmo比的尿素+1%SDS和Zmo呱的鹽酸孤各漂洗兩次，能去除大部分菌體蛋白(見(jiàn)圖2一7)，包涵體沒(méi)有溶解。3.2包涵體變性將包涵體用6mo呱尿素直接變性溶解，實(shí)驗(yàn)證實(shí)融合蛋白Trx.HPvl6LI無(wú)需添加Dl，r、疏基乙醇或還原型谷膚甘膚就能很好的溶解，表明融合蛋白的二硫鍵主要以還原態(tài)的形式存在。3.3融合蛋白柱層析復(fù)性與純化采取透析復(fù)性與柱上復(fù)性相結(jié)合的方法，逐步去除變性劑，靶蛋白含有6xHis標(biāo)簽，吸附在鎳離子金屬鰲合柱上，經(jīng)10Ommol/L咪哇洗脫去除雜蛋白后，300們。們n01幾咪哇洗脫活性蛋白峰(見(jiàn)圖2一8)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2746691