【摘要】：目的：(1)構(gòu)建凋亡素基因原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)、提純凋亡素融合蛋白，為進(jìn)一步制備其單克隆抗體提供物質(zhì)基礎(chǔ)；(2)構(gòu)建帶真核核糖體結(jié)合位點(Kozak序列)的凋亡素基因真核表達(dá)載體，提高凋亡素基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)效率。 方法：以pcDNA-VP3質(zhì)粒為模板，通過一次PCR方法，擴(kuò)增出不帶真核核糖體結(jié)合位點的凋亡素VP3基因；通過兩次PCR方法，擴(kuò)增出帶有真核核糖體結(jié)合位點的凋亡素VP3基因。分別將其克隆到原核表達(dá)載體pET-DsbA及真核表達(dá)載體pRevTRE的多克隆位點，構(gòu)建成凋亡素基因原核表達(dá)載體pET-DsbA-VP3及真核表達(dá)載體pRevTRE-VP3，進(jìn)行雙酶切及測序鑒定。進(jìn)一步將正確克隆有凋亡素基因的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliBL21(DE3)plysS中，以異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，固化Ni離子金屬鏊合純化帶6X組氨酸標(biāo)簽的凋亡素融合蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析目的蛋白。 結(jié)果：凋亡素基因原核及真核表達(dá)載體測序鑒定結(jié)果表明，本研究合成的凋亡素基因與Noteborn等報告的凋亡素基因序列一致，同源性為100％，并在真核表達(dá)載體凋亡素基因起始密碼前添加了Kozak序列。轉(zhuǎn)化的E.coliBL21(DE3)plysS經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，固化Ni離子金屬鏊合親和層析純化蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得分子量為38.3KD的目的蛋白條帶。 結(jié)論：(1)構(gòu)建的凋亡素基因原核表達(dá)載體pET-DsbA-VP3能表達(dá)出凋亡素融合蛋白；(2)通過兩次PCR的方法，能擴(kuò)增出起始密碼5’端添加Kozak序列的凋亡素基因，并能成功構(gòu)建其真核表達(dá)載體pRevTRE-VP3。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346
【圖文】：

士學(xué)位論文結(jié)果素原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)pET一nsbA及pET一nsb舟vp3轉(zhuǎn)化結(jié)果pET一DsbA及pET一DsbA一vP3轉(zhuǎn)化感受態(tài)節(jié)陽性的LB培養(yǎng)平板，倒置于37℃恒溫一Zllun乳白色菌落，見圖1、圖2。

士學(xué)位論文結(jié)果素原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)pET一nsbA及pET一nsb舟vp3轉(zhuǎn)化結(jié)果pET一DsbA及pET一DsbA一vP3轉(zhuǎn)化感受態(tài)節(jié)陽性的LB培養(yǎng)平板，倒置于37℃恒溫一Zllun乳白色菌落，見圖1、圖2。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2741219