【摘要】：目的：(1)構(gòu)建凋亡素基因原核表達載體，誘導(dǎo)表達、提純凋亡素融合蛋白，為進一步制備其單克隆抗體提供物質(zhì)基礎(chǔ)；(2)構(gòu)建帶真核核糖體結(jié)合位點(Kozak序列)的凋亡素基因真核表達載體，提高凋亡素基因在腫瘤細胞中的表達效率。 方法：以pcDNA-VP3質(zhì)粒為模板，通過一次PCR方法，擴增出不帶真核核糖體結(jié)合位點的凋亡素VP3基因；通過兩次PCR方法，擴增出帶有真核核糖體結(jié)合位點的凋亡素VP3基因。分別將其克隆到原核表達載體pET-DsbA及真核表達載體pRevTRE的多克隆位點，構(gòu)建成凋亡素基因原核表達載體pET-DsbA-VP3及真核表達載體pRevTRE-VP3，進行雙酶切及測序鑒定。進一步將正確克隆有凋亡素基因的原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliBL21(DE3)plysS中，以異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)誘導(dǎo)表達，固化Ni離子金屬鏊合純化帶6X組氨酸標(biāo)簽的凋亡素融合蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析目的蛋白。 結(jié)果：凋亡素基因原核及真核表達載體測序鑒定結(jié)果表明，本研究合成的凋亡素基因與Noteborn等報告的凋亡素基因序列一致，同源性為100％，并在真核表達載體凋亡素基因起始密碼前添加了Kozak序列。轉(zhuǎn)化的E.coliBL21(DE3)plysS經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，固化Ni離子金屬鏊合親和層析純化蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得分子量為38.3KD的目的蛋白條帶。 結(jié)論：(1)構(gòu)建的凋亡素基因原核表達載體pET-DsbA-VP3能表達出凋亡素融合蛋白；(2)通過兩次PCR的方法，能擴增出起始密碼5’端添加Kozak序列的凋亡素基因，并能成功構(gòu)建其真核表達載體pRevTRE-VP3。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346
【圖文】：

士學(xué)位論文結(jié)果素原核表達載體的構(gòu)建及表達pET一nsbA及pET一nsb舟vp3轉(zhuǎn)化結(jié)果pET一DsbA及pET一DsbA一vP3轉(zhuǎn)化感受態(tài)節(jié)陽性的LB培養(yǎng)平板，倒置于37℃恒溫一Zllun乳白色菌落，見圖1、圖2。

士學(xué)位論文結(jié)果素原核表達載體的構(gòu)建及表達pET一nsbA及pET一nsb舟vp3轉(zhuǎn)化結(jié)果pET一DsbA及pET一DsbA一vP3轉(zhuǎn)化感受態(tài)節(jié)陽性的LB培養(yǎng)平板，倒置于37℃恒溫一Zllun乳白色菌落，見圖1、圖2。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 孫國敬,童新,孫志賢;凋亡素的克隆及誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2001年02期

2 龔偉,薛立娟,孫大輝,王宏偉,葛濤,羅琴芳,李萍,金寧一;pIRVP3/pIRHNVP3核酸表達質(zhì)粒的構(gòu)建及對腫瘤細胞的影響[J];免疫學(xué)雜志;2002年01期

3 劉岳龍,崔治中,秦愛建,葉建強,段玉友,金文杰;第46代雞貧血病病毒細胞凋亡素基因的體外擴增、克隆、序列比較[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2001年05期

4 胡俊波,吳在德,顏子穎,侯云德;攜帶HSV-TK基因的人肝癌特異性EB病毒表達載體的構(gòu)建及臨床意義[J];中華實驗外科雜志;1999年02期

5 孫大輝,金寧一,谷貴山,龔偉,段德生;凋亡素誘導(dǎo)人成骨肉瘤細胞多藥耐藥株凋亡的研究[J];中國腫瘤生物治療雜志;2001年03期

6 譚芳,張玉靜,徐彥波,劉萬臣,張艷宇,柳鳳琴;凋亡素(apoptin)誘導(dǎo)人白血病細胞的凋亡[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2001年06期

7 陸承平;最新脊椎動物病毒分類簡介[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;1996年01期

8 韋莉,楊兵,周文平,韓蘇平,沈冰,劉爵;雞傳染性貧血病毒分離株凋亡素基因的克隆及序列測定[J];中國獸醫(yī)雜志;2001年11期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 蔡筱彥;凋亡素基因轉(zhuǎn)入人類肝癌細胞誘導(dǎo)細胞凋亡研究[D];暨南大學(xué);2002年

本文編號：2741219