【摘要】： 心肌肥大是心肌細(xì)胞對(duì)多種病理刺激的一種共同應(yīng)答方式，是指心肌細(xì)胞的體積增大而數(shù)量不變。由心肌肥大而心衰，由心衰而死亡是上述臨床病人的主要死亡原因之一。因此，探索治療和控制心肌肥大的特異性有效藥物不僅是當(dāng)今世界科學(xué)家們面臨的主題和研究熱點(diǎn)之一，也是我國(guó)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域急待解決的重要課題。已有研究表明，無(wú)論牽張刺激或是體液內(nèi)分泌物質(zhì)如內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、去甲腎上腺素等誘導(dǎo)心肌肥大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中G蛋白起著“分子開(kāi)關(guān)”樣的重要作用。新近報(bào)道G alpha的競(jìng)爭(zhēng)性抑制肽(GCIP)在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型上，對(duì)手術(shù)逆向主動(dòng)脈縮窄模型(TAC)的心肌肥大及內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ等刺激的MAPK活性改變均具有很好的抑制效果，且在試驗(yàn)過(guò)程中未觀察到任何毒副反應(yīng)，因此成為極有希望的抗心肌肥大新型藥物，而具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，首次表達(dá)及純化GCIP，并對(duì)GCIP的抗心肌肥大活性進(jìn)行初步研究。旨在為進(jìn)一步研究其抗心肌肥大功能及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。并為最終獲得具有特異性抗心肌肥大生物活性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向多肽分子藥物提供理論依據(jù)。 方法：1．化學(xué)合成GCIP基因，分段克隆入pIVEX2.3MCS質(zhì)粒，并測(cè)序鑒定；2．分別用RTS500系統(tǒng)和BL21(DE3)細(xì)菌表達(dá)GCIP，SDS-PAGE及Western blotting鑒定；3．用鎳螯合親和層析方法純化GCIP，細(xì)菌表達(dá)的GCIP采用固相復(fù)性方法，對(duì)變性蛋白進(jìn)行復(fù)性；4．采用乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)，去甲腎上腺素致肥大模型，測(cè)3H-亮氨酸摻入量及總蛋白含量。 結(jié)果：1．構(gòu)建的pIVEX2.3MCS-GCIP表達(dá)載體，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的完 WP=8 全一致。2．用RTS500系統(tǒng)和BL21(DE3)細(xì)菌成功表達(dá)了的GCIP，RTS表達(dá)的GCIP占反應(yīng)液總蛋白的2.43%；BL21(DE3)細(xì)菌表達(dá)GCIP為包涵體， 37℃ 4小時(shí)表達(dá)量為細(xì)菌總蛋白的6.55%、包涵體中的GCIP含量達(dá)53%；30℃ 12小時(shí)表達(dá)量為細(xì)菌總蛋白的9.13%、包涵體中的GCIP含量高達(dá)73%以上。3．RTS系統(tǒng)和BL21細(xì)菌表達(dá)的GCIP經(jīng)鎳柱純化后，SDS-PAGE顯示均能得到一條分子量約8.5kD的單一的條帶。4．對(duì)GCIP的抗心肌肥大作用做了初步研究，結(jié)果顯示10ng組3H-Leu摻入量和總蛋白含量已有下降趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)分析相差不顯著，100ng組GCIP已明顯減少3H-Leu摻入量和總蛋白含量（P0.01），1μg組和10μg組更低，但與100ng組相比相差無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(提示達(dá)到飽和濃度)。 結(jié)論：1．構(gòu)建了GCIP的表達(dá)載體pIVEX2.3MCS-GCIP。2．成功用RTS500系統(tǒng)表達(dá)GCIP蛋白，并經(jīng)鎳柱純化，其表達(dá)量約為100μg/ml。3．成功用BL21（DE3）細(xì)菌表達(dá)GCIP，表達(dá)量約占菌體總蛋白的10%，并經(jīng)鎳柱純化及復(fù)性，產(chǎn)量為250ml菌液約純化得1.5mg GCIP。4．GCIP具有抗心肌肥大活性且呈劑量依賴性
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R346
【圖文】：

軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 GCIP 基因的克隆、表達(dá)及其抗心肌肥大作用的結(jié) 果EGFP-A 的構(gòu)建成的第一、二條寡核苷酸單鏈退火后形成的帶粘性末端的雙A，定向克隆入 pEGFP-N1 質(zhì)粒的 Xho I 位點(diǎn)和 Pst I 位點(diǎn)之間稱之為 pEGFP-A。其篩選和鑒定可通過(guò) Hind Ⅲ和 Pst I 分酶切，如能被 Pst I 切開(kāi)，而不能被 Hind Ⅲ切開(kāi)，則為陽(yáng)性重 2）

·15·圖 4 pIVEX2.3MCS-GCIP 質(zhì)粒測(cè)序圖（僅為其中一小部份）測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)要求對(duì)比完全一致，可以進(jìn)行表達(dá)工作。討 論一、表達(dá)系統(tǒng)的選擇分析 GCIP 基因內(nèi)僅有一個(gè)半胱氨酸，分子內(nèi)沒(méi)有二硫鍵，且未見(jiàn)其分子需要糖基化或磷酸化的報(bào)道，故可選用原核表達(dá)系統(tǒng)。在原核表達(dá)系統(tǒng)中T7 RNA 聚合酶/啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)是利用 T7 RNA 聚合酶對(duì) T7 基因 10 啟動(dòng)子的高效轉(zhuǎn)錄而大量合成外源基因的mRNA。但 T7 RNA 聚合酶的高效轉(zhuǎn)錄作用幾乎耗盡細(xì)胞中的核苷三磷酸，從而抑制宿主 RNA 聚合酶有效轉(zhuǎn)錄宿主基因，抑制宿主細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。解決方案主要有兩種：一是通過(guò)體外翻譯系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，目前通用的不多。二是使細(xì)菌在生長(zhǎng)期不表達(dá)或低表達(dá) T7 RNA

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號(hào)：2738955