【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)可引起急、慢性病毒性肝炎，導(dǎo)致肝纖維化(LC)，甚至肝細(xì)胞癌(HCC)。HCV非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)蛋白由631個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為70KDa，在HCV感染的慢性化、致纖維化、致癌作用中非常重要。 為研究HCV NS3蛋白的結(jié)合蛋白，我們用酵母雙雜交技術(shù)篩選表達(dá)型cNDA白細(xì)胞文庫(kù)中與丙型肝炎病毒NS3蛋白結(jié)合蛋白的基因。首先用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)法擴(kuò)增NS3基因，連接入酵母表達(dá)載體pGBKT-7中構(gòu)建誘餌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109并在其內(nèi)表達(dá)，然后與轉(zhuǎn)化了人白細(xì)胞文庫(kù)質(zhì)粒的酵母細(xì)胞Y187進(jìn)行配合，在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上進(jìn)行雙重篩選陽(yáng)性菌落，增菌后提出質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(DH5α)，提出質(zhì)粒并測(cè)序，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果成功克隆出NS3基因并在酵母細(xì)胞中表達(dá)，配合后選出既能在四缺(SD／-Trp-Leu-Ade-His)培養(yǎng)基又能在鋪有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并變成藍(lán)色的真陽(yáng)性菌落18個(gè)，其中4個(gè)真核細(xì)胞翻譯延伸因子2；2個(gè)免疫球蛋白λ輕鏈；1個(gè)肌動(dòng)蛋白β；1個(gè)鐵蛋白輕多肽；1個(gè)(絲裂原)活化蛋白激酶3；2個(gè)肌球蛋白因子1；1個(gè)白細(xì)胞介素2受體β；1 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 個(gè)富含精氨酸/絲氨酸剪切因子6:1個(gè)組織蛋白酶S;1個(gè)2’一5’- 寡腺甘酸合成酶類(lèi)似物:1個(gè)缺失精子缺乏相關(guān)蛋白2;1個(gè)CNNZ; 1個(gè)新基因。上述結(jié)果表明已成功克隆出HCV NS3的結(jié)合蛋白，為 進(jìn)一步研究HCV的作用提供了新線(xiàn)索。 為了探索HCV NS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我 們應(yīng)用微矩陣(microarray)技術(shù)對(duì)于轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的肝母細(xì)胞 瘤細(xì)胞系HepGZ進(jìn)行分析。首先根據(jù)HCv一H病毒株序列設(shè)計(jì)、合 成序列特異性的引物。以含有全長(zhǎng)Hcv一H株。DNA的pBRTM一30n 質(zhì)粒DNA作為模板，進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，獲得的HCV NS3 編碼基因片段克隆到TA載體中進(jìn)行核昔酸序列的測(cè)定，構(gòu)建真核 表達(dá)載體pcDNA3一NS3。然后以pcDNA3一NS3轉(zhuǎn)染肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系 HepGZ，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行表達(dá)譜基因芯片分析。 最后應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù) (bioinformaties)，克隆HCV Ns3反式激活作用的新的靶基因。 結(jié)果顯示構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3一NS3經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶作圖 分析和核昔酸序列分析證實(shí)正確無(wú)誤。應(yīng)用分子克隆技術(shù)結(jié)合生 物信息學(xué)技術(shù)克隆獲得NS3反式激活的新型靶基因，命名為 NS3TP6。新基因的編碼基因序列全長(zhǎng)為414個(gè)核昔酸(nt)，編碼 產(chǎn)物由138個(gè)氨基酸殘基(aa)組成，是一種典型的病毒基因組 編碼的具有反式激活作用的蛋白。研究還表明，微矩陣技術(shù)是分 析基因表達(dá)譜變化的有效的高通量技術(shù)。發(fā)現(xiàn)的HCV NS3反式激 活作用的新的靶基因，并成功克隆了其中的NS3TP6，為闡明HCV Ns3蛋白的反式激活作用及其機(jī)制，開(kāi)辟了新的研究方向。 為研究NS 3TP6的結(jié)合蛋白，用酵母雙雜交技術(shù)篩選白細(xì)胞中 與Ns3TP6蛋白結(jié)合蛋白的基因。首先用多聚酶鏈反應(yīng)(P CR)法 擴(kuò)增HCV NS3TP6蛋白基因，連接入酵母表達(dá)載體pGBKT一7中構(gòu)建 誘餌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109并在其內(nèi)表達(dá)，然后與轉(zhuǎn)化了人 白細(xì)胞文庫(kù)質(zhì)粒的酵母細(xì)胞Y187進(jìn)行配合，在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 上進(jìn)行雙重篩選陽(yáng)性菌落，增菌后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，提 取質(zhì)粒并測(cè)序，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果成功克隆出Hcv NS3TP6 蛋白基因并在酵母細(xì)胞中表達(dá)，配合后選出在四缺 (SD產(chǎn)Trp一Leu一Ade一HIS)培養(yǎng)基和鋪有X一a一半乳糖(X一a一gal) 的四缺培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)并變成藍(lán)色的真陽(yáng)性菌落共7個(gè)，其中3 個(gè)人類(lèi)白細(xì)胞CD14抗原，1個(gè)人類(lèi)免疫球蛋白入輕鏈，3個(gè)人類(lèi) 推定蛋白基因(AC 1 24014，AC097504，AC023785)。以上實(shí)驗(yàn)成功 克隆出NS3TP6蛋白的結(jié)合蛋白，為進(jìn)一步研究HCV的作用提供了 新線(xiàn)索。 為了進(jìn)一步研究NS3TP6可能的分子生物學(xué)功能，我們應(yīng)用基 因芯片技術(shù)，檢測(cè)丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)反式激活 基因NS3TP6的表達(dá)對(duì)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HepGZ基因表達(dá)譜的影響。 以分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建NS3TP6的真核表達(dá)載體 peDNA3.1。)一NS3TP6，以表達(dá)質(zhì)粒peDNA3.1卜)一NS3TP6轉(zhuǎn)染HepGZ 細(xì)胞，以空載體poDNA3.1。)為平行對(duì)照，制備轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裂解 液，提取瓜RNA。應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)差異表達(dá)mRNA進(jìn)行檢 測(cè)和分析。結(jié)果顯示，HepGZ細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染NS3TP6后，有7條基因 表達(dá)增強(qiáng)，38條基因表達(dá)降低。應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片成功篩選了 NS3TP6的反式調(diào)節(jié)基因，為進(jìn)一步闡明NS3TP6的反式激活作用及 免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新的依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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2 董菁 ,施雙雙 ,王業(yè)東 ,皇甫競(jìng)坤 ,李莉 ,張玲霞 ,成軍;cDNA文庫(kù)噬菌體展示法的建立及乙型肝炎病毒前S1蛋白結(jié)合蛋白篩檢[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2002年04期

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