【摘要】： 膽固醇(cholesterol，Ch)代謝紊亂是膽系疾病形成的重要物質(zhì)基礎，既往研究證實Ch能改變膽囊動力，Ch結石患者的膽囊及高Ch飼養(yǎng)后動物膽囊收縮性下降，認為這是高Ch引起結石的原因。目前，Ch代謝紊亂對膽管及膽管括約肌(sphincter of bile duct，SBD)功能、結構的影響及其在疾病發(fā)生中的作用日益受到人們的重視，我們的研究發(fā)現(xiàn)：膽固醇脂質(zhì)體(cholesterol liposome，CL)不僅影響兔SBD平滑肌細胞骨架的構形、數(shù)量，而且不同濃度的CL對細胞的增殖亦有明顯作用。膽道系統(tǒng)除了SBD主要由平滑肌細胞構成之外，其它部位還存在著大量成纖維細胞(fibroblast，F(xiàn)b)，這些Fb對Ch的反應性及其在膽管構形演變中的作用，未見報道。我們采用體外培養(yǎng)的膽管Fb研究Ch對其增殖和表型的影響及機理，探討Pb的增殖及表型轉化與膽管括約肌重塑的關系。 1 目的 (1)研究Ch對兔膽管Fb增殖的影響，并對其機制進行探討。 (2)觀察Ch對兔膽管在體及離體Fb表型的影響。 2 方法 (1)分離、純化、培養(yǎng)兔膽管Fb，完全隨機分為三組：對照組、中等濃度Ch組(0.6g/L)和高濃度Ch(1.2g/L)。 (2)以MTT法測定各組細胞的增殖情況。 (3)流式細胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)測定各組細胞周期。 (4)采用免疫組化法定量分析各組細胞內(nèi)增殖細胞核抗原(PCNA)的表達情況。 (5)制作實驗性高Ch血癥模型，純種新西蘭兔16只，完全隨機分為兩組：對照組(標準飼料)，實驗組(標準飼料+Ch)，喂8 第四果醫(yī)大學碩士學位論文 一 周。 “）取各組兔膽管制作電鏡標本，進行觀察。 （）分離、培養(yǎng)、鑒定正常兔膽管 Fb，完全隨機分為三組［分組 同問）］，作用72h，制作電鏡標本，進行觀察三 倍）運用激光共聚焦顯微鏡（laser scanmng co恤cal microscopy， LSCop分析各組〔分組同口問細胞內(nèi)細胞骨架及a－acin的表達 情況。 3結果 問）中等濃度 Chu．4心．sg／L）可以使培養(yǎng)的免膽管 Fb MtA叩＿ 值顯著升高，Ch（0．4g／L）A490nm值為 0．42D0．015，較對照組增加 ＊力％（P＜0＊5）；m（0＊叭）抑。＊值達到最大為0．46即對19，較 對照組增力95．2％（P＜0．of）；0．sg／LCh組A49咖值為0．47210刀17 較對照組增力 89．6％（P＜0刀1）；高濃度 Ch（1．Zg／L）明顯抑本細 胞生長，＊M。nm值為0二63土0＊18，較對照組下降34．5％（P＜0＊5）。 Q）FCM分析顯示，與正常組相比，中等濃度 Ch門．6叭）顯 著增加 GZM期細胞比例，從 9．8％上升為 I3刀％，S期細胞比例從 11．7％上升為33．4％，而顯著減少進入GO／GI期的細胞比例，從 78．5％下降為 53．6％。高濃度 Ch O．Zgh）顯著減少 GZM期細胞 比例，從 9．8O降低為 6．7％，S期細胞比例從 11．7％下降為 5．9％， 而顯著增加進入GO／GI期的細胞比例，從78．5％上升為87．4％， 使更多的膽管Fb處于相對靜止期。 （3）PCNA免疫組織化學實驗表明，對照組膽管Fb的PCNA染 色，核內(nèi)無明顯的陽性反應顆粒，染色強度為 88．3hil石％AU； 0石g／LCh組膽管Fb的PCNA染色強陽性，染色強度為126．3flo．2％ AUu功．05，vs對照組），可見胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕褐色顆粒；1．Zgh Ch — —4—— 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 一 可使膽管 Fb核內(nèi)棕褐色顆粒顯著減少，染色強度為 96．3＊11．4％AU u動刀5，vs中濃度 Ch組卜 （4）透射電鏡下正常組膽管Fb呈梭形，胞漿內(nèi)有豐富的粗面內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)Oough endoplasmic reticulm，RER），線粒體和微絲的含量 較少，無基膜存在，呈典型的Fb的表型。高Ch喂養(yǎng)的兔膽管Fb RER明顯減少，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量的微絲，以質(zhì)膜下分布最多，成 束的微絲交錯處有密體形成，細胞質(zhì)膜處有密斑和不連續(xù)的基膜 形成，呈現(xiàn)平滑肌樣細胞表型。 u）體外培養(yǎng)的免膽管Fb亦呈典型的Fb的表型，經(jīng)中等濃度 Chm．6g／L）刺激 72 h后。膽管 Fb內(nèi)出現(xiàn)大量的微絲，但未見密 體、密斑及不連續(xù)的基膜形成。 “）LSCM顯示，0．6g／L Ch組細胞內(nèi)出現(xiàn)大量規(guī)則排列的成束的 微絲。a－actin表達量明顯增多，平均熒光值為1628．32t189．24 （P動刀1Js對照組卜 1．Zg／L Ch組膽管 Fb內(nèi)微絲顯著減少，a｛ctin 表達量減少，平均熒光值為 1427．281153．36（P功力5／S中濃度 Ch組卜 對照組膽管Fb 內(nèi)無明顯的微絲，平均熒光值為 1215．28土116．48。 4結論 O）中等濃度Ch促進兔膽管Fb增殖，其機制可能與細胞內(nèi)PCNA 的表達有關 Q）Ch可使兔膽管Fb出現(xiàn)平滑肌細胞的表型特點，體內(nèi)環(huán)境下 該變化更明顯，說明此過程有體內(nèi)其它因子參與，其機制尚待進 一步研究。
【學位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R363
【圖文】：

4.倒置顯微鏡下培養(yǎng)的膽管Fbx250.4.CultuxedbileduetfibroblastsobservedbyinvertmieroseoPe群儀、

圖4.倒置顯微鏡下培養(yǎng)的膽管Fbx250Fig.4.CultuxedbileduetfibroblastsobservedbyinvertmieroseoPe

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本文編號：2731793