【摘要】：人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在人群中感染普遍,能夠在免疫功能不全的病人中引起嚴(yán)重的疾病,特別是器官移植病人、艾滋病患者以及有先天性HCMV感染的新生兒。目前還沒有運用于臨床的HCMV疫苗。雖然臨床上已經(jīng)有一些針對HCMV感染的治療性藥物,但存在毒性及耐藥性等問題,因此研發(fā)出有效預(yù)防HCMV感染的疫苗尤為重要。病毒樣顆粒(virus-like particle VLP)疫苗是一種新型的亞單位疫苗。VLP是不含病毒基因組,不具有病毒復(fù)制能力的多聚蛋白結(jié)構(gòu)。乙肝病毒核心抗原(hepatitis B virus core protein,HBcAg)作為蛋白載體可以提高目的抗原的免疫原性,在VLP疫苗研究中運用廣泛。本實驗室前期研究表明,與HCMV UL83基因同源的小鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)M84基因在小鼠體內(nèi)能夠引起較強的細(xì)胞免疫應(yīng)答,有效抵抗致死量病毒感染。在本文中,將M84的一段含有一個T細(xì)胞優(yōu)勢表位的基因序列與HBcAg基因共表達制成VLP疫苗(簡稱HBc-M84ep),以MCMV感染Balb/c小鼠為模型,探究HBc-M84ep蛋白抗致死量MCMV攻擊的保護效果。本研究分為兩個部分。(一)HBc-M84ep亞單位疫苗的制備:選取HBcAg的1-149位氨基酸序列,將含有M84優(yōu)勢表位(297AYAGLFTPL305)的一段51個氨基酸序列插入并替換掉HBcAg的75-84位氨基酸,構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達,表達出的蛋白經(jīng)過裂解、超聲破碎、Ni-珠純化、超濾等一系列操作得到單一的目的蛋白,即HBc-M84ep蛋白,經(jīng)western blotting鑒定得到確認(rèn)。(二)HBc-M84ep亞單位疫苗的免疫保護效果:選取6-8周齡的小鼠隨機分組,分別用1μg、6μg、30μg劑量的HBc-M84ep蛋白單獨或輔以MF59佐劑進行腹腔免疫,免疫兩次,間隔三周。未免疫組小鼠作為對照。第二次免疫三周后用致死量MCMV攻擊小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn),劑量為1μg的HBc-M84ep蛋白單獨免疫小鼠不能為小鼠提供抗致死量MCMV的感染,與對照組小鼠一樣,在攻毒后的7天內(nèi)全部死亡;6μg和30μg HBc-M84ep蛋白單獨免疫小鼠能為小鼠提供部分保護,存活率僅為10%和40%。在該蛋白疫苗中添加MF59佐劑后,1μg、6μg和30μg蛋白劑量均能為小鼠提供較好的保護,其中免疫1μg劑量的小鼠其存活率達90%,免疫6μg或30μg劑量的小鼠存活率都達到100%。此外,完全保護組或保護率較高的組別與對照組或保護效果較差的組別相比,器官(包括脾臟和唾液腺)病毒滴度以及特異性抗體滴度都有著顯著性差異。研究結(jié)果表明,在乙肝病毒核心抗原基因序列中插入MCMV M84的一個優(yōu)勢表位序列,表達出的HBc-M84ep蛋白輔以MF59佐劑免疫小鼠,能為小鼠抗致死量MCMV攻擊提供有效保護,保護效果與疫苗劑量成正相關(guān)。該研究為研制新型HCMV疫苗提供了參考。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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本文編號：2731346