【摘要】：人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在人群中感染普遍,能夠在免疫功能不全的病人中引起嚴(yán)重的疾病,特別是器官移植病人、艾滋病患者以及有先天性HCMV感染的新生兒。目前還沒有運(yùn)用于臨床的HCMV疫苗。雖然臨床上已經(jīng)有一些針對HCMV感染的治療性藥物,但存在毒性及耐藥性等問題,因此研發(fā)出有效預(yù)防HCMV感染的疫苗尤為重要。病毒樣顆粒(virus-like particle VLP)疫苗是一種新型的亞單位疫苗。VLP是不含病毒基因組,不具有病毒復(fù)制能力的多聚蛋白結(jié)構(gòu)。乙肝病毒核心抗原(hepatitis B virus core protein,HBcAg)作為蛋白載體可以提高目的抗原的免疫原性,在VLP疫苗研究中運(yùn)用廣泛。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,與HCMV UL83基因同源的小鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)M84基因在小鼠體內(nèi)能夠引起較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答,有效抵抗致死量病毒感染。在本文中,將M84的一段含有一個(gè)T細(xì)胞優(yōu)勢表位的基因序列與HBcAg基因共表達(dá)制成VLP疫苗(簡稱HBc-M84ep),以MCMV感染Balb/c小鼠為模型,探究HBc-M84ep蛋白抗致死量MCMV攻擊的保護(hù)效果。本研究分為兩個(gè)部分。(一)HBc-M84ep亞單位疫苗的制備:選取HBcAg的1-149位氨基酸序列,將含有M84優(yōu)勢表位(297AYAGLFTPL305)的一段51個(gè)氨基酸序列插入并替換掉HBcAg的75-84位氨基酸,構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá),表達(dá)出的蛋白經(jīng)過裂解、超聲破碎、Ni-珠純化、超濾等一系列操作得到單一的目的蛋白,即HBc-M84ep蛋白,經(jīng)western blotting鑒定得到確認(rèn)。(二)HBc-M84ep亞單位疫苗的免疫保護(hù)效果:選取6-8周齡的小鼠隨機(jī)分組,分別用1μg、6μg、30μg劑量的HBc-M84ep蛋白單獨(dú)或輔以MF59佐劑進(jìn)行腹腔免疫,免疫兩次,間隔三周。未免疫組小鼠作為對照。第二次免疫三周后用致死量MCMV攻擊小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn),劑量為1μg的HBc-M84ep蛋白單獨(dú)免疫小鼠不能為小鼠提供抗致死量MCMV的感染,與對照組小鼠一樣,在攻毒后的7天內(nèi)全部死亡;6μg和30μg HBc-M84ep蛋白單獨(dú)免疫小鼠能為小鼠提供部分保護(hù),存活率僅為10%和40%。在該蛋白疫苗中添加MF59佐劑后,1μg、6μg和30μg蛋白劑量均能為小鼠提供較好的保護(hù),其中免疫1μg劑量的小鼠其存活率達(dá)90%,免疫6μg或30μg劑量的小鼠存活率都達(dá)到100%。此外,完全保護(hù)組或保護(hù)率較高的組別與對照組或保護(hù)效果較差的組別相比,器官(包括脾臟和唾液腺)病毒滴度以及特異性抗體滴度都有著顯著性差異。研究結(jié)果表明,在乙肝病毒核心抗原基因序列中插入MCMV M84的一個(gè)優(yōu)勢表位序列,表達(dá)出的HBc-M84ep蛋白輔以MF59佐劑免疫小鼠,能為小鼠抗致死量MCMV攻擊提供有效保護(hù),保護(hù)效果與疫苗劑量成正相關(guān)。該研究為研制新型HCMV疫苗提供了參考。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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本文編號：2731346