【摘要】： 目的 在骨組織工程中大量生物降解和可吸收材料，已經進行了廣泛研究。細胞外支架是提供細胞粘附，增生和分化的基礎，也是將生長因子固定于細胞組分上并維持其三維空間結構，允許新的組織生成的支撐物。雖然，一些人對脫細胞膜的細胞骨架進行了描述，但迄今為止還沒有見到較理想的脫細胞骨細胞外基質的制備及骨細胞外基質骨陷窩計量檢測的詳細報道．本實驗進行脫細胞骨基質制備，去除細胞成分，并進行形態(tài)學觀察，為骨組織工程的新型天然支架材料提供依據(jù)。同時對脫細胞基質的成分和實驗中所使用的除垢劑Triton x-100的殘留量進行了檢測。 材料與方法 1．脫細胞兔骨細胞外基質的制備： 用戊巴比妥鈉將兔麻醉，取雙側脛骨，修整成片狀，剔除骨膜，PBS徹底清洗。向廣口瓶中加入Tris-HCl緩沖液，緩沖液內加入蛋白酶抑制劑，放入骨片，4℃下恒溫震蕩。然后把瓶內液體換成 內含 3暢 Triton x河 的 Tis－HCI（PH7．4）緩沖液洞樣也加人 上述蛋白酶抑制劑，4℃恒溫震蕩后，用蒸餾水連續(xù)沖洗。之后加 入 DNas。和 RNase混合液室溫下消化。再次向瓶中加人內含 3％ TitonxJ 的TiS－HCI緩沖液，4t下恒溫震蕩。蒸餾水充分 沖洗后，將制備的脫細胞的骨片放人TiS－HCI（PH7．4）緩沖液 中，4℃下保存?zhèn)溆谩Ｃ摷毎墓瞧肰on Ebnel氏脫鈣液脫鈣 15 天。 2．組織學檢測 脫鈣后脫細胞的基質用10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋， 切片后進行HE染色、Mallory－Heidenhain氏快速一步法染色、阿 利新藍染色，光鏡觀察。 3．掃描電鏡 將沒有脫鈣骨片用1．25％戊H醛一4％多聚甲醛固定掃描電 鏡觀察。 4．骨陷窩的形態(tài)測量方法和測量指標 Mallory－Heidenhain氏快速一步法染色的正常和脫細胞骨組 織各取10張標本，每個標本隨機取10個視野，我們使用LUZEX －F實時圖像分析系統(tǒng)在400倍普通光鏡觀察下，測量骨陷窩密 度，并對500個骨陷窩的表面積、平均周長、長徑、短徑、骨陷窩間 平均距離進行了檢測。 5．鏈霉素親生物素一過氧化物酶法染色u－P） 脫細胞細胞外基質經脫鈣后石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟；梯度 酒精水化；通過免疫組化方法標記纖維連結蛋白和層連蛋白。以 PBS置換一抗作為空白對照。 6．免疫組織化學電鏡觀察 脫細胞細胞外基質經免疫組化S－P染色后俄酸固定；逐級 丙酮脫水；Epon浸透包埋。超薄切片后 JEM－1200EX Electron nlC］SSOpe觀察。 ·2· 7．反相高效液相色譜（Rp－HPLC）檢測 Titon x刁00殘留量 高效液相色譜柱（SPhPriSOOb C18）5卜m、15nun X 6ruml．D．；流 動相：乙睛／水（體積比 1：l人流速：二 1llHniln；溫度：40 t；檢測波 長：28Onm；進樣量：5pl。朋S為空白對照，隊 sp＊M＊ 血J卜V ITriton x－100為對照品，在上述色譜條件下檢測，3min出峰。 取脫細胞骨基質稱重，將其鉗碎研磨至糊狀，加人PBS混勻，體積 到6Inl，取0．SInl樣品加人甲醇0．SInl后1，0009上0min／t離心， 取上清液。分別取 0·SInl樣品加人 0．spl、lpl、sgl Titon x－100 后加人甲醇0．sail后10009在 廣t離心，取上清液。在上述色 譜條件下檢測。 結 果 一、脫細胞骨細胞外基質形態(tài)學觀察和計量學檢測結果 1．大體觀察 與新鮮勝骨相比，經脫細胞處理的兔勝骨脫細胞細胞外基質 外觀顏色更淺淡，更自一些；我們同時也使用不同濃度的除垢劑和 脫細胞時間進行了脫細胞處理，證明 30天組并用3％Titon x－ 100脫細胞效果最好，光鏡和電鏡觀察下脫細胞徹底。 2．組織學檢測 HE染色、Mallory－Heidenhain氏快速一步法染色、阿利新藍 染色：光鏡下，脫細胞骨基質膠原纖維排列整齊，橢圓形骨陷窩內 空虛，無骨細胞核及其他結構。 3．掃描電鏡觀察 正常勝骨掃描電鏡觀察骨陷窩中骨細胞清晰可見。脫細胞勝 骨掃描電鏡觀察僅見骨基質結構，骨陷窩空虛，骨陷窩內壁光滑規(guī) 則，無任何細胞殘留物。 4．骨陷窩的形態(tài)計量學結果：我們對骨陷窩的密度和一些組 ·3· 織形態(tài)學參數(shù)做了測量。這些參數(shù)對測算骨細胞的大小有重要意 義，根據(jù)體視學原理估計單位體積骨組織合細胞數(shù)，進而對工程骨 的構建提供實驗依據(jù)。 二、在脫細胞細胞外基質中纖維連結蛋白和層連蛋白的檢測 S－P法染色結果：纖維連結蛋白抗體和層連蛋白抗體的染色 陽性部位在細胞外基質，清晰棕色為陽性，以細胞外基質無棕色或 背景一致淺棕色為陰性。在脫細胞細胞外基質的骨陷窩周邊部染 色較深，呈篩網狀、線狀分布，為清晰棕色。陰性對照組未見棕色。 免疫組織化學電鏡觀察結果：在細胞外基質骨陷窩周邊部彌 散存在陽性標記，電子密度較高的DAB反應產物呈四塊，網狀分 布�；|內可見網狀纖維結構，膠原纖維排列整齊。 三、RP－HPLC分析Titon x－100殘留量 對照品出峰時
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2730680