【摘要】： 目的 在骨組織工程中大量生物降解和可吸收材料，已經(jīng)進(jìn)行了廣泛研究。細(xì)胞外支架是提供細(xì)胞粘附，增生和分化的基礎(chǔ)，也是將生長(zhǎng)因子固定于細(xì)胞組分上并維持其三維空間結(jié)構(gòu)，允許新的組織生成的支撐物。雖然，一些人對(duì)脫細(xì)胞膜的細(xì)胞骨架進(jìn)行了描述，但迄今為止還沒有見到較理想的脫細(xì)胞骨細(xì)胞外基質(zhì)的制備及骨細(xì)胞外基質(zhì)骨陷窩計(jì)量檢測(cè)的詳細(xì)報(bào)道．本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行脫細(xì)胞骨基質(zhì)制備，去除細(xì)胞成分，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，為骨組織工程的新型天然支架材料提供依據(jù)。同時(shí)對(duì)脫細(xì)胞基質(zhì)的成分和實(shí)驗(yàn)中所使用的除垢劑Triton x-100的殘留量進(jìn)行了檢測(cè)。 材料與方法 1．脫細(xì)胞兔骨細(xì)胞外基質(zhì)的制備： 用戊巴比妥鈉將兔麻醉，取雙側(cè)脛骨，修整成片狀，剔除骨膜，PBS徹底清洗。向廣口瓶中加入Tris-HCl緩沖液，緩沖液內(nèi)加入蛋白酶抑制劑，放入骨片，4℃下恒溫震蕩。然后把瓶?jī)?nèi)液體換成 內(nèi)含 3暢 Triton x河 的 Tis－HCI（PH7．4）緩沖液洞樣也加人 上述蛋白酶抑制劑，4℃恒溫震蕩后，用蒸餾水連續(xù)沖洗。之后加 入 DNas。和 RNase混合液室溫下消化。再次向瓶中加人內(nèi)含 3％ TitonxJ 的TiS－HCI緩沖液，4t下恒溫震蕩。蒸餾水充分 沖洗后，將制備的脫細(xì)胞的骨片放人TiS－HCI（PH7．4）緩沖液 中，4℃下保存?zhèn)溆�。脫�?xì)胞的骨片用Von Ebnel氏脫鈣液脫鈣 15 天。 2．組織學(xué)檢測(cè) 脫鈣后脫細(xì)胞的基質(zhì)用10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋， 切片后進(jìn)行HE染色、Mallory－Heidenhain氏快速一步法染色、阿 利新藍(lán)染色，光鏡觀察。 3．掃描電鏡 將沒有脫鈣骨片用1．25％戊H醛一4％多聚甲醛固定掃描電 鏡觀察。 4．骨陷窩的形態(tài)測(cè)量方法和測(cè)量指標(biāo) Mallory－Heidenhain氏快速一步法染色的正常和脫細(xì)胞骨組 織各取10張標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取10個(gè)視野，我們使用LUZEX －F實(shí)時(shí)圖像分析系統(tǒng)在400倍普通光鏡觀察下，測(cè)量骨陷窩密 度，并對(duì)500個(gè)骨陷窩的表面積、平均周長(zhǎng)、長(zhǎng)徑、短徑、骨陷窩間 平均距離進(jìn)行了檢測(cè)。 5．鏈霉素親生物素一過氧化物酶法染色u－P） 脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)脫鈣后石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟；梯度 酒精水化；通過免疫組化方法標(biāo)記纖維連結(jié)蛋白和層連蛋白。以 PBS置換一抗作為空白對(duì)照。 6．免疫組織化學(xué)電鏡觀察 脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)免疫組化S－P染色后俄酸固定；逐級(jí) 丙酮脫水；Epon浸透包埋。超薄切片后 JEM－1200EX Electron nlC］SSOpe觀察。 ·2· 7．反相高效液相色譜（Rp－HPLC）檢測(cè) Titon x刁00殘留量 高效液相色譜柱（SPhPriSOOb C18）5卜m、15nun X 6ruml．D．；流 動(dòng)相：乙睛／水（體積比 1：l人流速：二 1llHniln；溫度：40 t；檢測(cè)波 長(zhǎng)：28Onm；進(jìn)樣量：5pl。朋S為空白對(duì)照，隊(duì) sp＊M＊ 血J卜V ITriton x－100為對(duì)照品，在上述色譜條件下檢測(cè)，3min出峰。 取脫細(xì)胞骨基質(zhì)稱重，將其鉗碎研磨至糊狀，加人PBS混勻，體積 到6Inl，取0．SInl樣品加人甲醇0．SInl后1，0009上0min／t離心， 取上清液。分別取 0·SInl樣品加人 0．spl、lpl、sgl Titon x－100 后加人甲醇0．sail后10009在 廣t離心，取上清液。在上述色 譜條件下檢測(cè)。 結(jié) 果 一、脫細(xì)胞骨細(xì)胞外基質(zhì)形態(tài)學(xué)觀察和計(jì)量學(xué)檢測(cè)結(jié)果 1．大體觀察 與新鮮勝骨相比，經(jīng)脫細(xì)胞處理的兔勝骨脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì) 外觀顏色更淺淡，更自一些；我們同時(shí)也使用不同濃度的除垢劑和 脫細(xì)胞時(shí)間進(jìn)行了脫細(xì)胞處理，證明 30天組并用3％Titon x－ 100脫細(xì)胞效果最好，光鏡和電鏡觀察下脫細(xì)胞徹底。 2．組織學(xué)檢測(cè) HE染色、Mallory－Heidenhain氏快速一步法染色、阿利新藍(lán) 染色：光鏡下，脫細(xì)胞骨基質(zhì)膠原纖維排列整齊，橢圓形骨陷窩內(nèi) 空虛，無骨細(xì)胞核及其他結(jié)構(gòu)。 3．掃描電鏡觀察 正常勝骨掃描電鏡觀察骨陷窩中骨細(xì)胞清晰可見。脫細(xì)胞勝 骨掃描電鏡觀察僅見骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)，骨陷窩空虛，骨陷窩內(nèi)壁光滑規(guī) 則，無任何細(xì)胞殘留物。 4．骨陷窩的形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果：我們對(duì)骨陷窩的密度和一些組 ·3· 織形態(tài)學(xué)參數(shù)做了測(cè)量。這些參數(shù)對(duì)測(cè)算骨細(xì)胞的大小有重要意 義，根據(jù)體視學(xué)原理估計(jì)單位體積骨組織合細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而對(duì)工程骨 的構(gòu)建提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 二、在脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)中纖維連結(jié)蛋白和層連蛋白的檢測(cè) S－P法染色結(jié)果：纖維連結(jié)蛋白抗體和層連蛋白抗體的染色 陽性部位在細(xì)胞外基質(zhì)，清晰棕色為陽性，以細(xì)胞外基質(zhì)無棕色或 背景一致淺棕色為陰性。在脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的骨陷窩周邊部染 色較深，呈篩網(wǎng)狀、線狀分布，為清晰棕色。陰性對(duì)照組未見棕色。 免疫組織化學(xué)電鏡觀察結(jié)果：在細(xì)胞外基質(zhì)骨陷窩周邊部彌 散存在陽性標(biāo)記，電子密度較高的DAB反應(yīng)產(chǎn)物呈四塊，網(wǎng)狀分 布�；|(zhì)內(nèi)可見網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，膠原纖維排列整齊。 三、RP－HPLC分析Titon x－100殘留量 對(duì)照品出峰時(shí)
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2730680