【摘要】：目的: 1998年Mauri和Zhai等相繼發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子超家族的第14個成員—LIGHT（homologous to lymphotoxins, inducible, competes with HSV glycoprotein D for HVEM, expressed by T lymphocyte），并報道了其分子量、染色體定位及在體外試驗中激活NF-κB轉(zhuǎn)位、刺激T細(xì)胞增生和抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29生長的生物學(xué)活性。LIGHT mRNA高表達于脾臟、激活的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在體外試驗中，佛波酯（PMA）和植物血凝素（PHA）或PMA和離子霉素均能誘導(dǎo)人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）LIGHT mRNA表達。同其他TNF超家族成員一樣，LIGHT蛋白為典型的Ⅱ型跨膜蛋白，其胞外區(qū)近膜端可被金屬蛋白激酶E酶解并脫落形成分子量約為24KD的可溶性蛋白（hsLIGHT）。該蛋白與分布于不同細(xì)胞表面的不同受體相互作用發(fā)揮不同的生物學(xué)作用：一方面，hsLIGHT與分布于腫瘤細(xì)胞（如人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29等）表面的淋巴毒素受體 （lymphotoxin ( recepter，LT(R）相互作用，經(jīng)非半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）依賴途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡；另一方面，其與T細(xì)胞表面的單純皰疹病毒進入介導(dǎo)物 （herpesvirus entry mediator, HVEM）相互作用，通過非CD28依賴途徑共刺激 WP=4 T細(xì)胞的增殖、活化。另外其在樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DCs）的分化成熟、胸腺細(xì)胞的陰性選擇、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)、自身免疫的發(fā)生、器官移植的免疫排斥中也起著重要作用。鑒于：（1）與hsLIGHT結(jié)合后介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的LT(R僅表達在腫瘤細(xì)胞表面，而在其它正常細(xì)胞不表達或低表達；（2）T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體與hsLIGHT結(jié)合后可刺激T細(xì)胞的活化、增殖，而T細(xì)胞在機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著重要作用；（3）hsLIGHT能發(fā)揮與全長人LIGHT（hLIGHT）相同的生物學(xué)作用，而hsLIGHT片段較小，易于克隆、表達，且表達產(chǎn)物容易純化等原因。本研究對hsLIGHT基因進行了克��；構(gòu)建了其原核重組融合蛋白表達質(zhì)粒pGEX-4T-2/hsLIGHT；選用具有成本低、蛋白表達量高、容易純化等優(yōu)點的大腸桿菌表達系統(tǒng)，對其原核融合蛋白表達條件進行了初步探討。旨在進一步探討hsLIGHT的抗腫瘤生物學(xué)活性，探索腫瘤的免疫治療新方法，為hsLIGHT蛋白用于臨床腫瘤治療提供實驗依據(jù)，并為此種生物制劑的進一步生產(chǎn)、開發(fā)創(chuàng)造可能性。 方法：取培養(yǎng)的人早幼粒白血病細(xì)胞（HL60），分別加入終濃度為68 ng/ml的佛波酯（PMA）、0.3 μg/ml的離子霉素（ionomycin），37℃，5% CO2培養(yǎng)24h后，提取細(xì)胞總RNA，用自行設(shè)計的hsLIGHT特異性引物進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴增。將擴增產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，在含氨芐青霉素（Amp）的2YT培養(yǎng)基上篩選重組子，提取質(zhì)粒進行酶切鑒 WP=5 定和測序。用EcoR I和Xho I將目的片斷從pGEM-T Easy/hsLIGHT質(zhì)粒切下，與經(jīng)過相同酶切的原核表達載體pGEX-4T-2連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定后，構(gòu)建成原核表達重組質(zhì)粒pGEX-4T-2/hsLIGHT。挑選陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli BL21，在含氨芐青霉素的2YT液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5~1.0。加入不同濃度的IPTG誘導(dǎo)不同時間后，經(jīng)SDS-PAGE電泳觀察融合蛋白（GST-hsLIGHT）的表達，并利用Western Blot方法確定目的蛋白的存在。對陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，從1L細(xì)菌培養(yǎng)液中提取包涵體及上清蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析融合蛋白的表達，并用雙縮脲法測定包涵體蛋白含量。 結(jié)果：（1）經(jīng)測序可見構(gòu)建的pGEM-T Easy/hsLIGHT重組質(zhì)粒內(nèi)插入片斷序列與Genbank報道的人LIGHT基因胞外區(qū)序列完全一致。（2）以構(gòu)建的pGEX-4T-2/hsLIGHT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21，同時設(shè)pGEX-4T-2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli BL21和未轉(zhuǎn)化任何質(zhì)粒的E.coli BL21作為陰性對照組。加入終濃度分別為0.1 mmol/L、1 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L的IPTG ，37℃誘導(dǎo)2h、4h、6h、8h后，經(jīng)SDS-PAGE電泳觀察可見：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的E.coli BL21均無GST蛋白和GST-hsLIGHT融合蛋白的表達；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入pGEX-4T-2質(zhì)粒的E.coli BL21，在分子量約為26KD（GST）處可見一條蛋白條帶；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入pGEX-4T-2/hsLIGHT重組質(zhì)粒的E.coli BL21，在分子量約為47KD處可見一條蛋白條帶，與GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致，且經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)4h后均出現(xiàn)陽 WP=6 性條帶（GST-hsLIGHT）。Western Blot進一步證實該條帶確為GST-hsLIGHT融合蛋白。（3）提取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達的細(xì)菌包涵體，經(jīng)SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，GST-hsLIGHT融合蛋白主要存在于細(xì)菌包涵體中，而上清中未見陽性蛋白（GST-hsLIGHT）條帶。經(jīng)蛋白定量結(jié)果顯示，1L菌液可獲得包涵體蛋白16.5mg。 結(jié)論：本研究成功完成了人LIGHT胞外區(qū)（hsLIGHT）基因的克隆并構(gòu)建了hsLIGHT原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-2/hsLIGHT；以此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli BL21，在IPTG誘導(dǎo)下，成功表達了融合蛋白GST-hsLIGHT。為進一步研究LIGHT的抗腫瘤生物學(xué)活性奠定了良好的基礎(chǔ)；為今后將LIGHT作為一種治療腫瘤的生物制劑進一步生產(chǎn)開發(fā)提供了重要保證。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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本文編號：2728064