【摘要】： 弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）是一種呈世界性分布的機(jī)會(huì)性致病原 蟲(chóng)，所致的弓形蟲(chóng)病是免疫功能低下人群的重要并發(fā)癥，有時(shí)甚至是致 死病因；受弓形蟲(chóng)感染的孕婦可將其垂直傳播給胎兒，造成孕婦流產(chǎn)、 早產(chǎn)以及胎兒的死胎、畸胎等，存活的胎兒也往往伴隨弓形蟲(chóng)性腦、眼 疾病等嚴(yán)重的后遺癥；弓形蟲(chóng)病又是一種人獸共患病，其爆發(fā)流行對(duì)畜 牧業(yè)也造成極大損失。研制有效的弓形蟲(chóng)的疫苗和對(duì)感染弓形蟲(chóng)的患者 （尤其是受感染的孕婦）做出早期診斷，是當(dāng)前弓形蟲(chóng)病防治工作中的 兩大主題。 在經(jīng)歷了減毒或弱毒疫苗后，針對(duì)弓形蟲(chóng)病的疫苗的研究目前主要 集中在以保護(hù)性抗原為基礎(chǔ)成分的蛋白疫苗和核酸疫苗上。以單一抗原 成分構(gòu)成的疫苗，往往因?yàn)槠浜械牧馨图?xì)胞結(jié)合位點(diǎn)少、受機(jī)體 MHC限制性比較大，對(duì)形態(tài)多變、抗原成分復(fù)雜的蟲(chóng)體，難以形成有 力攻擊。而以多抗原成分及強(qiáng)免疫佐劑構(gòu)成的多價(jià)復(fù)合疫苗，可以從多 方位、多層次激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答系統(tǒng)，提高機(jī)體的免疫保護(hù)力。 由于弓形蟲(chóng)病缺乏特異性臨床癥狀和體征，診斷仍是弓形蟲(chóng)病防治 中一個(gè)突出的問(wèn)題。目前臨床上常用的是免疫學(xué)診斷方法。但同國(guó)外的 一些試劑盒相比，我國(guó)目前還缺乏一種令人滿(mǎn)意的診斷試劑盒，其主要 原因是很難獲得一種純度高、尤其是抗原反應(yīng)性強(qiáng)的蟲(chóng)體抗原。憑借現(xiàn) 代分子生物學(xué)等手段，可以獲得能夠滿(mǎn)足這種條件的重組抗原，從而提 高試劑盒敏感性和特異性。 本課題設(shè)計(jì)并合成了編碼弓形蟲(chóng)多表位抗原的基因，分別在原核的 大腸桿菌（E.coli）表達(dá)系統(tǒng)和真核的甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母（Methylotrophic yeasl）表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了初步表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的抗原活性進(jìn)行了初步 分析。 一、弓形蟲(chóng)多表位抗原的基因構(gòu)建及合成 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)弓形蟲(chóng)抗原表位的分析結(jié)果，分別從弓形蟲(chóng)保護(hù) 性抗原SAGI、ROPZ、GRAZ中，選取了共4段、分別含有T細(xì)胞表位 和（或）B細(xì)胞表位的抗原片段，以及1個(gè)含T細(xì)胞表位、起免疫增強(qiáng) 作用的破傷風(fēng)毒素片段P30，作為弓形蟲(chóng)多表位抗原的基本成分。為了 使各片段在表達(dá)后仍保持各自獨(dú)立的空間構(gòu)象，發(fā)揮表位特有的作用， 通過(guò)軟件進(jìn)行模擬分析和比較，在片段之間插入了適當(dāng)數(shù)目的非極性氨 基酸。在確定了弓形蟲(chóng)多表位抗原氨基酸序列的基礎(chǔ)上，選取真核表達(dá) 系統(tǒng)偏愛(ài)的密碼子，得到編碼這段復(fù)合抗原的堿基序列（基因序列）。 該基因序列通過(guò)DNA合成儀一次性合成。酶切和測(cè)序結(jié)果證實(shí)該合成 的基因片段與預(yù)先所設(shè)計(jì)的完全相符。 二、弓形蟲(chóng)多表位基因在原核系統(tǒng)中的初步表達(dá)及對(duì)表達(dá)產(chǎn)物抗原 活性的初步分析。 將多表位抗原基因克隆入原核表達(dá)載體pRSETB，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大 腸桿菌 BLZI（DE3），以 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，得到分于量為 14．4KD左右 的目的蛋白產(chǎn)物。該蛋白產(chǎn)物以不可溶的包涵體形式存在。優(yōu)化誘導(dǎo) 條件以后，其表達(dá)量可占菌體總蛋白的20％左右。以抗弓形蟲(chóng)P30的單 克隆抗體引3對(duì)該表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行抗原活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在不經(jīng)復(fù)性的情況 下，其即可被特異識(shí)別；隨后將超聲破菌所得的粗包涵體用于DipstiCk 法對(duì)弓形蟲(chóng)抗體的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明弓形蟲(chóng)多表位基因的原核表達(dá)產(chǎn) 物能被弓形蟲(chóng)感染的人陽(yáng)性血清所特異識(shí)別。 三、多表位基因在酵母系統(tǒng)中的初步表達(dá)及對(duì)表達(dá)產(chǎn)物抗原活性的 初步分析 將多表位抗原基因克隆入酵母表達(dá)載體 pPICZ Q C，重組質(zhì)粒完全線(xiàn) 性化后，以氯化纏法轉(zhuǎn)化甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母X33，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，得到大小 約為60KD的特異條帶。隨后進(jìn)行的免疫印跡反應(yīng)中，其不能被單克隆 抗體S3所識(shí)別，但可被弓形蟲(chóng)感染血清所特異識(shí)別，證明其具有一定 的抗原慚件。 －4－ 本課題在國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道了弓形蟲(chóng)多表位抗原的編碼基因的構(gòu)建， 以及其分別在原核和真核體系的初步表達(dá)。所獲得的表達(dá)產(chǎn)物分別具有 一定的抗原活性。尤其經(jīng)原核表達(dá)的重組抗原，不經(jīng)復(fù)性即具有與抗體 結(jié)合的強(qiáng)特異性反應(yīng)性。這不僅為后面弓形蟲(chóng)病疫苗的研制提供了依 據(jù)，也可以為弓形蟲(chóng)病診斷試劑盒的研制提供包被抗原。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類(lèi)號(hào)】：R382.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 呂石頭,楊必順,楊遠(yuǎn);一豬場(chǎng)暴發(fā)弓形蟲(chóng)病[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;1999年04期

2 郭虹,陳觀今,鄭煥欽,周永安,呂芳麗;弓形蟲(chóng)ROP1基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒免疫小鼠后的免疫應(yīng)答[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;1999年06期

3 陳海峰,陳觀今,郭虹,鄭煥欽,王又紅;弓形蟲(chóng)復(fù)合抗原基因SAG1/ROP1在大腸桿菌中表達(dá)的初步研究[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2001年02期

4 于恩庶;對(duì)國(guó)內(nèi)市售弓形蟲(chóng)病診斷試劑盒的評(píng)價(jià)和建議[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2001年03期

本文編號(hào)：2717065