【摘要】： 根據(jù)已發(fā)表的PERV gag基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增PERV gag基因的引物，并在引物5′端分別引入Sal Ⅰ、Not Ⅰ酶切位點(diǎn)。從中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬外周血淋巴細(xì)胞RNA中擴(kuò)增gag基因。將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑白色菌落，經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，NotⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定、篩選陽(yáng)性克隆重組子。對(duì)陽(yáng)性克隆，用ABI377自動(dòng)序列分析儀進(jìn)行全序列測(cè)定，用DNASIS和NCBI的BLAST2.0程序進(jìn)行同源性比較。序列分析結(jié)果表明，所克隆的gag基因全長(zhǎng)1 572bp，編碼524個(gè)氨基酸；與其它來(lái)源的同源序列相比較，僅有三個(gè)核苷酸存在變異。分別是位于N端第1054位的C→T，位于N端第1180位的A→G，及位于N端第1560位的A→C的變異。 為進(jìn)一步探討PERV gag蛋白的特性與功能。提取PERV gag重組質(zhì)粒pGEM-gag，Not Ⅰ、Sal Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒，凝膠純化后，插入經(jīng)同樣酶切處理的pGEX-4T-3融合表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR和NotⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆，用ABI377自動(dòng)序列分析儀進(jìn)行全序列測(cè)定，測(cè)定顯示其具有正確的讀碼框。將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌株，并對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果顯示：pGEX-gag在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，融合蛋白分子量為86KDa，與理論推算值相符，測(cè)得該蛋白表達(dá)量約為18％。從誘導(dǎo)3h的菌液中提取包涵體，上清與沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉淀中于86KDa處有一很濃的蛋白帶，而上清中幾乎沒(méi)有，表明pGEX-gag在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物主要以不溶性的包涵體形式存在。對(duì)其進(jìn)行變性、復(fù)性處理后，利用離子交換層析柱對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行了初步純化。將融合蛋白免疫大耳白兔，用ELISA法檢測(cè)到抗PERV抗體， 1 中文摘要 效價(jià)為 1：32 000，用表達(dá)的gag融合蛋白作為包被抗原初步建立了間接ELISA 法。結(jié)果，表達(dá)的GST—gag蛋白具有良好的抗原性和特異性，為從分子水平上 對(duì) PERV gag蛋白的功能性研究和發(fā)展 PERV基因工程監(jiān)測(cè)試劑奠定了基礎(chǔ)。 具有特異抗原性的GST融合蛋白的成功表達(dá)為豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒監(jiān)測(cè)試 劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)，對(duì)保障豬源生物制品的安全具有意義。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2715133