【摘要】： 創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)是一種有莢膜的革蘭陰性嗜鹽的弧菌，存在于海水及海產(chǎn)品中，由Farmer等于1979年首先報道。本菌主要引起原發(fā)性敗血癥和嚴(yán)重的創(chuàng)口感染。敗血癥多與生食含菌的牡蠣等貝類海產(chǎn)品有關(guān)，尤其好發(fā)于肝硬化、血色素沉著癥、地中海貧血等體內(nèi)荷鐵量過多的人群中，病死率超過50％。皮膚創(chuàng)口受海水中的創(chuàng)傷弧菌感染，常導(dǎo)致嚴(yán)重的組織壞死。創(chuàng)傷弧菌的確切致病機(jī)理至今尚未完全明了。溶細(xì)胞素是由結(jié)構(gòu)基因vvhA編碼的一種分子量為50,851Da的細(xì)胞外蛋白，對熱不穩(wěn)定，能溶解哺乳動物紅細(xì)胞及中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，是創(chuàng)傷弧菌向胞外釋放的唯一細(xì)胞毒素，一直被認(rèn)為是創(chuàng)傷弧菌重要的致病因子。 本文采用高保真PCR從創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株GTC333中擴(kuò)增全長的vvhA基因，T-A克隆測序后構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)pET32a(+)-vvhA-BL21DE3，用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)vvhA融合蛋白表達(dá)，SDS-PAGE檢測vvhA融合蛋白分子量。其產(chǎn)物將作為創(chuàng)傷弧菌基因工程疫苗及診斷試劑盒的抗原。 實驗方法 1．創(chuàng)傷弧菌的培養(yǎng)： 將日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研室贈送的創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株GTC333菌株涂布于血平板培養(yǎng)基上，于需氧環(huán)境37℃培養(yǎng)過夜，見細(xì)小白色菌落、周圍有完全溶血環(huán)，革蘭染色為陰性細(xì)小弧菌，經(jīng)浙大醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院檢驗科細(xì)菌自動分析儀檢定為創(chuàng)傷弧菌。 2．創(chuàng)傷弧菌模板DNA制備： 采用常規(guī)苯酚—氯仿法提取創(chuàng)傷弧菌GTC333株DNA，經(jīng)無DNA酶的RNA酶消 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 李永濤 化后，再次用苯酚一氯仿法提取的DNA溶于TE緩沖液中，用分光光度法測定DNA 的濃度和純度。 3.PCR擴(kuò)增: 根據(jù)創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株GTC333vvhA參考核營酸序列和表達(dá)載體克隆位點內(nèi) 切酶圖譜分析結(jié)果，自行設(shè)計引物，由上海博亞生物技術(shù)有限公司(BioAsia)合 成。 vv隊基因引物序列如下:上游5仁GceG旦魚工旦旦ATGAAGAAAATGAeTeTG一3/(BamHI)， 下游5仁GeeAAGeTTeTAGAGTTTGAeTTGTTG一3/(Hind山)。 采用上海博彩生物科技有限公司(BBST)Pfu一Taq混合高保真PCR試劑盒擴(kuò)增vvhA 基因，PCR反應(yīng)總體積為1 00林1，引物濃度為250 nmol/L，100 ng DNA模板。PCR 反應(yīng)參數(shù):94oC5min，xl;94℃305，52oC3OS，72oCgOS，X 10;94oC3OS，52oC 305，72oCIOOS(以后每循環(huán)增加105)，x25;72℃10min，xl。1.5%的瓊脂糖凝 膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。 4.丁一A克隆、測序與表達(dá)載體的構(gòu)建: 采用BBST公司的T一A克隆試劑盒將擴(kuò)增的目的片段克隆至pUCm一T載體中， 轉(zhuǎn)化于E.Col 1 DH SQ株并擴(kuò)增，堿變性法提取質(zhì)粒。獲得滿意的測序結(jié)果后，分 別擴(kuò)增含pUCm一T一vvhA和pET32a(+)的E.eoli DHS。，提取質(zhì)粒后用雙酶切獲得 目的基因片段與pET32a(+)連接后轉(zhuǎn)化于E.coli BL21DE3，擴(kuò)增、提取質(zhì)粒后再 次測序，并與報道的 vvhA基因核營酸序列進(jìn)行同源性比較。 5.重組蛋白表達(dá)與純化: pET32a(+)一vvhA一BL21DE3在分別含1.0、0.5和0.1 mmol/L IPTG的LB培養(yǎng) 基中震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度為37℃;IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物用超聲波破碎，S000r/min4℃ 離心10 min后分別取上清和沉淀;采用10% SDS一PAGE檢查目的蛋白的表達(dá)情況。 用NTA親和層析法(BBST)收集表達(dá)的目的蛋白。 結(jié)果 PCR 從創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株GTC333株DNA模板中獲得預(yù)期大小的vv隊擴(kuò)增條帶。 浙江人學(xué)碩卜學(xué)位論文 李永濤 2.核普酸序列分析: pUCm一T與pET32a卜)重組質(zhì)粒中的創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株GTC333株vvhA基因核 若酸序列完全相同。與己報道的vvhA序列比較，核營酸序列同源性為95.970rk， 據(jù)此推斷氨基酸序列同源性為98.51%. 3.目的融合蛋白的表達(dá): 1.0、0.5和0.1 mmol/L工PTG均能很好地誘導(dǎo)重組vvhA的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物 主要存在于菌體超聲破碎物離心后的沉淀中，表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的30%一 40%。 結(jié)論 本實驗所克隆的創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株GTC333株、，hA基因核昔酸序列與已報道 相應(yīng)序列比較，，核營酸序列同源性為95.97%，氨基酸序列同源性為98.51%，上述 結(jié)果表明，我們成功地從創(chuàng)傷弧菌基因組DNA中擴(kuò)增、克隆了vvhA基因。 本實驗構(gòu)建的pET32a(+)一vvhA一BL21DE3系統(tǒng)在較低IPTG濃度時(0.1 mm。1/L)也能很好地誘導(dǎo)重組vvllA的表達(dá)，其表達(dá)量高達(dá)細(xì)菌總蛋白3既一40?0 左右，并主要以包涵體形式存在。 本實驗成功地從創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中構(gòu)建了vvhA高效原核表達(dá)系統(tǒng)，可為進(jìn) 一步的致病機(jī)制的研究和免疫診斷試劑盒的抗原作準(zhǔn)備。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 生成選;創(chuàng)傷弧菌及其危害[J];山東畜牧獸醫(yī);2002年03期

2 吳斌,盧中秋;創(chuàng)傷弧菌感染的致病機(jī)制研究現(xiàn)狀[J];中國急救醫(yī)學(xué);2004年11期

3 許斌福,林天龍,董傳甫,伊光輝;鰻鱺創(chuàng)傷弧菌的分子鑒定[J];中國人獸共患病雜志;2005年11期

4 池勝英;周鐵麗;;創(chuàng)傷弧菌引起傷口感染1例[J];中國骨傷;2006年04期

5 王貴明;陳清;申洪;;創(chuàng)傷弧菌紫外線抗性觀察[J];中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志;2009年03期

6 李艷;陳清;申洪;;創(chuàng)傷弧菌攻擊對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系的影響[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年15期

7 朱鳳;李維克;;深圳市售海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌檢測分析[J];醫(yī)學(xué)動物防制;2011年04期

8 邢麗萍;周哠;;創(chuàng)傷弧菌生物學(xué)研究進(jìn)展[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2011年07期

9 劉少偉;阮贊林;;海洋生鮮美味之隱憂——海洋創(chuàng)傷弧菌的危害[J];質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化;2012年10期

10 權(quán)玉玲;胡曉寧;張t

本文編號：2708880