【摘要】：背景與目的 干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制和增殖分化能力的原始細(xì)胞，是形成生命機(jī)體各種組織器官的起源細(xì)胞。根據(jù)其發(fā)育階段，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞(Embryonic stemcells)和成體干細(xì)胞(Adult stem cells)。胚胎干細(xì)胞由于倫理、法律等原因研究和應(yīng)用受限，因此人們更加關(guān)注成體干細(xì)胞的研究。 成體干細(xì)胞的可塑性是目前研究的熱點領(lǐng)域，特定的組織干／祖細(xì)胞具有多向分化潛能，不僅可以分化為同一胚層來源的細(xì)胞，而且可以跨胚層“橫向分化”(Trans—Differentiation)為不同胚層來源的細(xì)胞。1999年美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)小鼠肌肉組織干細(xì)胞可以橫向分化成血液細(xì)胞，之后研究者又證實從胎兒腦組織中獲得的神經(jīng)干細(xì)胞能產(chǎn)生血液細(xì)胞，造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞能產(chǎn)生骨骼肌、心肌、肝細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞。 研究證明，臍帶血中富含造血干／祖細(xì)胞，是骨髓和外周血后的第三種造血干細(xì)胞來源。并且臍帶血中的造血干細(xì)胞的增殖能力與自我更新能力超過或相似于骨髓中的造血干細(xì)胞。而且隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)臍帶血中不但含有豐富的造血干細(xì)胞，還含有多潛能干細(xì)胞，也稱為間充質(zhì)干細(xì)胞，可向內(nèi)皮、血管以及神經(jīng)等組織分化。 干細(xì)胞在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究取得的成就，為肝臟疾病的治療研究提供了新的思路。成體干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化可向肝細(xì)胞移植、生物人工肝提供充足的供體，以期用來治療各種急、慢性肝功能衰竭和肝臟代謝性疾病。目前對體內(nèi)外誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化已有較多研究，但體外誘導(dǎo)臍帶血干細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞則少見報道。基于目前的研究現(xiàn)狀，本課題旨在探明人臍帶血單個核細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞能否在體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，并探索臍帶血干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的分化條件。另外通過觀察兩種生長因子的作用及其相應(yīng)受體的表達(dá)情況，探討這些因素在臍帶血干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化中的作用，從而在一定程度上探討分化的機(jī)制。 鄭州大學(xué)2004年碩士 體外誘導(dǎo)人臍帶血干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究 方法 無菌條件下穿刺臍靜脈，密閉式采血法采集正常產(chǎn)婦(妊娠36一42周)臍帶血， 構(gòu)椽酸鹽、磷酸鹽和葡萄糖(CPD)抗凝，用相對密度為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分 離臍帶血單個核細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色和蘇木素染核判定細(xì)胞活度及純度，進(jìn)而采用貼 壁培養(yǎng)法獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，單個核細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞用含1既胎牛血清的DMEM (高糖)進(jìn)行純化和擴(kuò)增培養(yǎng)，，用流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志。 對單個核細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞分別用肝細(xì)胞生長因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長 因子(FGF4)、倆者聯(lián)合、無生長因子四種處理因素，及含2%胎牛血清高糖D施M，1 X胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(ITS)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并于誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的第7、14、21、 28天留取細(xì)胞涂片或爬片，用RT一PCR法檢測肝細(xì)胞標(biāo)志物甲胎蛋白、白蛋白及兩 種生長因子的受體C一met、FGFRZ mRNA水平的表達(dá)，用免疫組化法檢測甲胎蛋白、白 蛋白、抗肝細(xì)胞抗體和CK18的表達(dá)，并用PAS法進(jìn)行糖原染色，分析是否誘導(dǎo)出肝 細(xì)胞樣細(xì)胞。 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(牙士s)表示，采用SPSS10.O統(tǒng)計學(xué)軟件，用單因素 方差分析和t檢驗對資料進(jìn)行統(tǒng)計分析。 結(jié)果 密度梯度離心法分離的臍帶血單個核細(xì)胞，活力及純度均95%。其中CD34+細(xì) 胞平均為0.%士0.12%。 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分離24小時后逐漸貼壁，l周后呈長梭形、克隆樣生長。 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)cD29、CD44，不表達(dá) CD34。 單個核細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞均在誘導(dǎo)前檢測到C一met、FGFRZ的少量表達(dá)，未檢 測到甲胎蛋白、白蛋白、抗肝細(xì)胞抗體、CK18、糖原的表達(dá)。 誘導(dǎo)后7天檢測出甲胎蛋白mRNA及蛋白水平的表達(dá)，21天檢測出白蛋白mRNA 及蛋白水平的表達(dá)，及CK18、抗肝細(xì)胞抗體蛋白水平的表達(dá)，隨誘導(dǎo)時間的延 鄭州大學(xué)2004年碩士研究生畢業(yè)論文體外誘導(dǎo)人臍帶血干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究 長C一met，F(xiàn)GFRZ mRNA表達(dá)增高，21天、28天均可檢測到糖原染色陽性細(xì)胞， 無生長因子誘導(dǎo)組在以上時間點均未檢測到上述指標(biāo)。 5.統(tǒng)計結(jié)果顯示，單個核細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞HGF+FGF4誘導(dǎo)組甲胎蛋白、白蛋 白、CK18、抗肝細(xì)胞抗體、糖原陽性率均高于單獨生長因子誘導(dǎo)組(P0.05); 上述指標(biāo)在單獨HGF、單獨FGF4誘導(dǎo)組間無明顯差異(P .05)。 結(jié)論 1.密度梯度離心法適于分離臍帶血單個核細(xì)胞，且活率和純度均較好。 2.密度梯度離心法加貼壁培養(yǎng)法適于分離臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞，活率及純度均較 局。 3.人臍帶血單個核細(xì)胞、間充質(zhì)千細(xì)胞均可在體外誘導(dǎo)分化為具有肝系細(xì)胞表型和 功能的細(xì)胞。 4.HGF、FGF4均能誘導(dǎo)人臍帶血干細(xì)胞分化為具有肝系細(xì)胞表型和功能的細(xì)胞， 且二者在一定程度上有聯(lián)合作用。 5.C一met、FGF凡mRNA在誘導(dǎo)前的人臍帶血單個核細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞均有低水 平表達(dá)，加生長因子誘導(dǎo)培養(yǎng)后表達(dá)水平增高。生長因子與其相應(yīng)受體之間，可 能存在正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 夏茂林;肝糖原和肌糖原[J];生物學(xué)教學(xué);1997年07期

2 侯玲玲,曹華,魏國榮,白慈賢,張涌,吳祖澤,裴雪濤;人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的研究[J];中華血液學(xué)雜志;2002年08期

本文編號：2708696