【摘要】： 腫瘤壞死因子(human tumor necrosis factor，hTNF)是由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種多功能細(xì)胞因子，其最顯著的活性特征是可以在體內(nèi)或體外特異性的殺傷多種腫瘤細(xì)胞。是一種有潛在應(yīng)用價(jià)值的抗腫瘤、抗病毒感染以及免疫調(diào)節(jié)生物制劑。TNF的臨床研究曾在在許多國家展開，但因其全身用藥毒副作用太大而限制了其臨床應(yīng)用。但利用提高腫瘤組織TNP-α濃度的技術(shù)和應(yīng)用基因工程手段制備高效低毒TNF-α突變體呈現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(rmhTNF)是本中心通過基因工程方法，去除TNF-α分子氨基端7個氨基酸殘基，并且把8、9、10和157位氨基酸突變構(gòu)建的一種改構(gòu)人TNF。rmhTNF比天然TNF體外殺傷L929細(xì)胞的活性增加1000倍左右，毒性降低3倍。器官或組織血管特異性的分子異 蘿四軍醫(yī)大學(xué)項(xiàng)士申位論文 質(zhì)性是一個普遍的現(xiàn)象。腫瘤轉(zhuǎn)移首選器官依賴于腫瘤細(xì)胞與該器官血管 床特定分子相互作用。通過噬菌體展示肽文庫技術(shù)可以篩選出與特定器官 特異性結(jié)合的多肽。GFE－l是應(yīng)用噬菌體多肽展示肽文庫篩選出的一種可 以在肺組織特異性富集的多肽，，含有13個氨基酸（C哩CVRQCPERC）， 它可 vx vx G田三肽與靶位結(jié)合。G田J 與肺結(jié)合的受體 MDP（membrane ipeptidase）是一個55上Da的肺微血管細(xì)胞表面蛋白，是一個包含在谷腴甘 肽、Leukotriene D。及 p－內(nèi)酞胺抗生素代謝過程中的細(xì)胞表面鋅金屬蛋白。 MDP以二硫鍵形成二聚體。主要分布于肺小血管內(nèi)皮及腎近球小管刷狀緣 區(qū)。應(yīng)用特異性多肽作為導(dǎo)向載體具有分子量，J、，構(gòu)建簡單等特點(diǎn)。它有 更低的免疫源性；可以選擇性地與腫瘤血管相結(jié)合，在體內(nèi)較容易到達(dá)腫 瘤組織深部，主要與靶向蛋白功能重要的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，能更好的發(fā)揮“彈頭 分子”殺傷作用。我們利用基因工程方法，將GFEl肽融合在inhTNF－a的 氨基端，期望其能特異性在肺組織富集，以達(dá)到治療肺部腫瘤的目的。我 們?nèi)斯ず铣闪司幋aGFE－l的寡核旮酸片斷，與rlnhTNF基因連接后，克隆 入 pGEM3zf卜）質(zhì)粒；序列分析表明，合成片斷成功的插入 rmLhTNF的氨 基端。將融合基固克隆APBV220表達(dá)載體中，在大腸桿菌中得到高效表 達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白量的30％。以部分可溶形式存在，將裂菌上清經(jīng) 過硫酸鉻分段鹽析后，QSepharose FF陰離子交換柱層析和 SPSepharose FF 陽離子交換柱層析，可獲取純度＞87％的蛋白，蛋白回收率為2．58％。在此 基礎(chǔ)上用 L929細(xì)胞在體外證明了其生物學(xué)活性并對其進(jìn)行了體內(nèi)分布的研 究。體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在肺部富集水平高于肝、腎組織。且呈時(shí)間依從 性。免疫組化結(jié)果表明 GFE－l－inhTNF V以與肺血管及支氣管內(nèi)膜特異結(jié) 合。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2700604