【摘要】：目的:本研究擬從人腎細胞癌組織中克隆全長配對盒基因(paired box,Pax2),構建hPax2高效真核表達載體,通過轉染腎細胞癌(renal cell cancer,RCC)患者外周血單核細胞(PBMCs)并經誘導、培養(yǎng)獲得的未成熟DCs,制備hPax2/DCS疫苗,探討hPax2/DCS疫苗臨床應用的可行性。 方法:提取腎細胞癌組織總RNA,并以Oligo(DT)引物逆轉錄合成cDNA;根據GeneBank中人Pax2 mRNA全長開放讀框(M89470),設計擴增人Pax2完整開放讀框序列的PCR引物,分別引入限制性內切酶酶切位點;PCR擴增目的基因hPax2;將回收純化的PCR產物經限制性內切酶酶切后,T4連接酶定向克隆入原核表達載體pTrcHis2B,構建重組質粒pTrcHis2B-hPax2,切下目的基因片段,連接至真核表達載體pcDNA4/HisMax構建重組質粒pcDNA4/HisMaxp-hPax2,經酶切分析初步驗證后,DNA測序,確認hPax2全長開放讀框正確插入真核表達載體多克隆位點。 采集腎細胞癌患者血,分離PBMCs,以重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子、重組人白細胞介素-4和重組人腫瘤壞死因子-α誘導培養(yǎng),得到未成熟DCs和成熟DCs,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),流式細胞儀(FCM)分析細胞表型;以復合陽離子脂質體介導真核重組表達載體pcDNA4/HisMax-hPax2轉染未成熟DCs,反轉錄PCR(RT-PCR)檢測轉染細胞hPax2基因的表達;應用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包的Chi-Square test和One-way ANOVA進行統(tǒng)計學處理,P0.05作為差別有顯著性標準。 結果:經PCR擴增獲得1.2kb大小的目的基因片段,構建的重組質粒pTrcHis2B-hPax2經酶切及DNA測序鑒定,表明從人腎細胞癌組織中獲得完整Pax2基因開放讀框,序列無誤,插入方向正確。構建的真核表達重組質粒pcDNA4/HisMaxp-hPax2經限制性內切酶分析,表明重組正確。 倒置相差顯微鏡下可見貼壁的單核細胞聚集成散布的細胞集落;培養(yǎng)至第7天部分細胞懸浮生長,可見典型樹突狀細胞(dendritic cellS,DC_s)形態(tài);加入TNF-α培養(yǎng)至第10天,大部分細胞呈懸浮狀態(tài),細胞形態(tài)更典型;同時FCM分析顯示,RCC患者外周血中貼壁的PBMCs經rhGM-CSF和rhIL-4誘導培養(yǎng)第7天,細胞表面標志為典型的未成熟DCs表型:CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR均呈低表達,CD3幾乎無表達;PBMCs在rhGM-CSF+rhIL-4+TNF-α條件下,培養(yǎng)至第10天,細胞表面
【圖文】：

圖1.4PCR產物瓊脂糖電泳結果入DNA/反解1十班刀班nDNAMarkerl:初次PCR產物2:再次PCR產物B一hPaxZ的鑒定:析結果:axZ經Ibal單酶切后，電泳見一兩條帶:分別約為4.4kb和1.Zkb，小一致;同時以質粒為模板進行組織中PCR擴增得到的hPaxZ片段

和上述擴增的hPaxZPCR產物大小一致;同時以質粒為模板進行的PCR擴增，擴增產物也與hPaxZ大小符合(從腎癌組織中PCR擴增得到的hPaxZ片段作對照);證明重組克隆成功(圖1.5)。圖1.5重組pTreHisZB一hPaxZ酶切M:入DNA/反口尸1+為叮刀姐IDNAMarker1:pTreHisZB一hPaxZ雙酶切(肋刀I+肋al)2:pTreHisZB一hPaxZ單酶切以力al)3:堿裂解法提取pTreHisZB一hPaxZ重組質粒4:重組質粒為模板PCR產物電泳5:PCR擴增的hPaxZ產物
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻】

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1 朱學軍,曹雪濤,于益芝,陳國友,萬濤,馬施華,唐華,章衛(wèi)平;人外周血樹突狀細胞的體外擴增及鑒定[J];中國腫瘤生物治療雜志;1997年04期

2 曹雪濤;樹突狀細胞的基礎與臨床研究新進展[J];中國免疫學雜志;1998年03期

3 劉彬彬,葉勝龍,賀平,鄭寧,孫瑞霞,趙燕,湯釗猷;肝癌患者外周血樹突狀細胞的體外擴增、鑒定及內吞能力觀察[J];腫瘤;1999年05期

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本文編號：2699380