【摘要】：目的:本研究擬從人腎細(xì)胞癌組織中克隆全長配對(duì)盒基因(paired box,Pax2),構(gòu)建hPax2高效真核表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)染腎細(xì)胞癌(renal cell cancer,RCC)患者外周血單核細(xì)胞(PBMCs)并經(jīng)誘導(dǎo)、培養(yǎng)獲得的未成熟DCs,制備hPax2/DCS疫苗,探討hPax2/DCS疫苗臨床應(yīng)用的可行性。 方法:提取腎細(xì)胞癌組織總RNA,并以O(shè)ligo(DT)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;根據(jù)GeneBank中人Pax2 mRNA全長開放讀框(M89470),設(shè)計(jì)擴(kuò)增人Pax2完整開放讀框序列的PCR引物,分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn);PCR擴(kuò)增目的基因hPax2;將回收純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后,T4連接酶定向克隆入原核表達(dá)載體pTrcHis2B,構(gòu)建重組質(zhì)粒pTrcHis2B-hPax2,切下目的基因片段,連接至真核表達(dá)載體pcDNA4/HisMax構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA4/HisMaxp-hPax2,經(jīng)酶切分析初步驗(yàn)證后,DNA測序,確認(rèn)hPax2全長開放讀框正確插入真核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)。 采集腎細(xì)胞癌患者血,分離PBMCs,以重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、重組人白細(xì)胞介素-4和重組人腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)培養(yǎng),得到未成熟DCs和成熟DCs,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀(FCM)分析細(xì)胞表型;以復(fù)合陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)真核重組表達(dá)載體pcDNA4/HisMax-hPax2轉(zhuǎn)染未成熟DCs,反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞hPax2基因的表達(dá);應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包的Chi-Square test和One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P0.05作為差別有顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果:經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得1.2kb大小的目的基因片段,構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrcHis2B-hPax2經(jīng)酶切及DNA測序鑒定,表明從人腎細(xì)胞癌組織中獲得完整Pax2基因開放讀框,序列無誤,插入方向正確。構(gòu)建的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA4/HisMaxp-hPax2經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析,表明重組正確。 倒置相差顯微鏡下可見貼壁的單核細(xì)胞聚集成散布的細(xì)胞集落;培養(yǎng)至第7天部分細(xì)胞懸浮生長,可見典型樹突狀細(xì)胞(dendritic cellS,DC_s)形態(tài);加入TNF-α培養(yǎng)至第10天,大部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài),細(xì)胞形態(tài)更典型;同時(shí)FCM分析顯示,RCC患者外周血中貼壁的PBMCs經(jīng)rhGM-CSF和rhIL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天,細(xì)胞表面標(biāo)志為典型的未成熟DCs表型:CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR均呈低表達(dá),CD3幾乎無表達(dá);PBMCs在rhGM-CSF+rhIL-4+TNF-α條件下,培養(yǎng)至第10天,細(xì)胞表面
【圖文】：

圖1.4PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果入DNA/反解1十班刀班nDNAMarkerl:初次PCR產(chǎn)物2:再次PCR產(chǎn)物B一hPaxZ的鑒定:析結(jié)果:axZ經(jīng)Ibal單酶切后，電泳見一兩條帶:分別約為4.4kb和1.Zkb，小一致;同時(shí)以質(zhì)粒為模板進(jìn)行組織中PCR擴(kuò)增得到的hPaxZ片段

和上述擴(kuò)增的hPaxZPCR產(chǎn)物大小一致;同時(shí)以質(zhì)粒為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物也與hPaxZ大小符合(從腎癌組織中PCR擴(kuò)增得到的hPaxZ片段作對(duì)照);證明重組克隆成功(圖1.5)。圖1.5重組pTreHisZB一hPaxZ酶切M:入DNA/反口尸1+為叮刀姐IDNAMarker1:pTreHisZB一hPaxZ雙酶切(肋刀I+肋al)2:pTreHisZB一hPaxZ單酶切以力al)3:堿裂解法提取pTreHisZB一hPaxZ重組質(zhì)粒4:重組質(zhì)粒為模板PCR產(chǎn)物電泳5:PCR擴(kuò)增的hPaxZ產(chǎn)物
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 朱學(xué)軍,曹雪濤,于益芝,陳國友,萬濤,馬施華,唐華,章衛(wèi)平;人外周血樹突狀細(xì)胞的體外擴(kuò)增及鑒定[J];中國腫瘤生物治療雜志;1997年04期

2 曹雪濤;樹突狀細(xì)胞的基礎(chǔ)與臨床研究新進(jìn)展[J];中國免疫學(xué)雜志;1998年03期

3 劉彬彬,葉勝龍,賀平,鄭寧,孫瑞霞,趙燕,湯釗猷;肝癌患者外周血樹突狀細(xì)胞的體外擴(kuò)增、鑒定及內(nèi)吞能力觀察[J];腫瘤;1999年05期

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本文編號(hào)：2699380