【摘要】： 研究背景 冠心病是當前危害人類健康的最主要疾病之一。隨著治療水平的不斷提高，冠心病的介入性治療-經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成型術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)可以明顯減輕病變血管的狹窄狀況，改善缺血心肌的血供，已經(jīng)成為與藥物治療、手術(shù)治療同等重要的第三種治療方法。PTCA的成功率可達95％以上，但約有35％～50％的病人在術(shù)后半年內(nèi)出現(xiàn)原發(fā)部位的再狹窄(restenosis，RS)，嚴重影響了遠期療效。目前的研究表明，再狹窄的發(fā)生機制中一個最重要的環(huán)節(jié)是血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在多種細胞因子的刺激下發(fā)生表型的改變、遷移、增殖并產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)是一種相對分子量為2.5×10~4的二聚體多肽，具有調(diào)節(jié)細胞生長和分化的功能。研究表明TGF-β可以調(diào)節(jié)成纖維細胞和損傷血管VSMC增生，增加細胞間質(zhì)的合成和分泌，增加細胞外基質(zhì)和細胞骨架的結(jié)合。本課題以TGF-β_1為對象，研究其在血管損傷后狹窄過程中對膠原積聚、VSMC增殖、整合素-粘著斑激酶(FAK)蛋白表達的作用，以期對血管再狹窄的機理和防治進行進一步的探討。 研究目的 1．在已建立的內(nèi)膜損傷后血管狹窄動物模型上，觀察損傷后內(nèi)膜增殖灶中TGF-β_1的表達及與Ⅰ、Ⅲ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的關(guān)系。觀察TGF-β_1對體外培養(yǎng)的大鼠VSMC分泌膠原及MMPs活性的影響。以探討TGF-β_1對細胞外基質(zhì)積聚的作用。2．觀察不同濃度的TGF-β_1刺激對體外培養(yǎng)的大鼠VSMC的增殖的影響。3．探討TGF-β_1對整合素-FAK表達的作用。 研究方法 南京醫(yī)科大學碩士學位論文 1.在已建立的腹主動脈內(nèi)膜損傷后血管狹窄的動物模型上(新西蘭大 白兔21只，隨機分為對照組和5組試驗組，每組各3只，分別于腹一骼動 脈聯(lián)合損傷術(shù)術(shù)后l周、2周、4周、3個月及4個月處死)應用分子及免 疫病理學的方法，用DIG標記的TGF一pl、I型膠原及MMP一9寡核普酸探 針、m型膠原杭體，進行原位雜交和免疫組織化學實驗，對TGF一p，、I、 m型膠原、MN[P一9的動態(tài)變化及相互關(guān)系進行探討。 2.進行大鼠胸主動脈VSMC原代培養(yǎng)，并用免疫組織化學的方法通過 抗鼠平滑肌細胞肌動蛋白(myosin)染色實驗來鑒定培養(yǎng)細胞的性質(zhì)。取 4一6代平滑肌細胞進行TGF一p:刺激，濃度為1 ng/ml、sng/ml、long/ml， 作用時間為24小時，應用3H一脯氨酸(3H一Proline，3H一PRL)摻入法檢測 VSMC分泌膠原的變化，并設(shè)立未加任何刺激的正常對照。同樣刺激后， 裂解細胞并收集細胞上清，用明膠酶譜法分別測定MMPs活性的改變。 3.取第4一6代VsMC行TGF一pl刺激，濃度為ing/ml、sng/ml、long/ml 作用時間為6小時，應用流式細胞儀測定并分析細胞DNA含量，用PCNA 免疚組織化學法和圖像分析，觀察TGF一p;對vsMc生長、增殖的影響。 4.在兔腹主動脈內(nèi)膜損傷后血管狹窄的動物模型上用原位雜交的方 法檢測FAK mRNA的表達。同上經(jīng)TGF一pl刺激6，J.時后，進行細胞免疫 組織化學實驗，，檢測整合素av、FAK蛋白的表達變化，從而探討TGF一pl 與整合素一FAK蛋白表達的關(guān)系。 5.原位雜交和免疫組化的結(jié)果以NYD一1 000型計算機圖像分析系統(tǒng)分 析。數(shù)據(jù)用5 PSS軟件統(tǒng)計分析。 研究結(jié)果 1.在已建立的兔腹主動脈內(nèi)膜損傷后血管狹窄的動物模型上，觀察了 內(nèi)膜損傷后4個月內(nèi)狹窄處新生內(nèi)膜中TGF一p，、I、In型膠原、MMP一9的 動態(tài)變化。結(jié)果顯示:內(nèi)膜損傷后2周TGF一p，和I型膠原的表達開始增多， 并逐漸增加至術(shù)后4個月。TGF一p，表達陽性細胞分布在增殖內(nèi)膜及靠近內(nèi) 南京醫(yī)科大學碩士學位論文 膜的中膜，I型膠原陽性顆粒在第2周前主要位于增生細胞的胞裝中，2周 后主要位于間質(zhì)。正常血管m型膠原mRNA的表達極低，損傷后1周迅 速增加，至4周達到峰值。MMP一9的表達在術(shù)后2一4周時達到高峰，至4 個月表達有所下降，中期主要分布在新生內(nèi)膜及中膜近外膜處，晚期(3- 4個月)主要位于彈力板周圍。 2.進行了SD大鼠胸主動脈VSMC的原代培養(yǎng)，并對培養(yǎng)細胞的來源 進行了免疫組織化學鑒定，證實為平滑肌細胞。通過’H一PRL摻入法檢測經(jīng) 不同濃度的TGF一p，刺激24小時后膠原的合成:小劑量TGF一p，刺激對 vMSc分泌膠原影響不大，但隨TGF一p:濃度增加，分泌膠原的量明顯增多， 與對照組比有顯著性差異。MMPS活性檢測結(jié)果表明，高濃度的TGF一pl 對MMP一2及MMP一9的活性有明顯抑制作用。 3.PCNA免疫組織化學結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度的TGF一p，刺激6小時后， 小劑量(Ing/ml)的TGF一p;即可以使平滑肌細胞PcNA的表達略有下降， 且隨著劑量的加大PCNA的陽性明顯減弱，且陽性細胞只以弱陽性為主。 流式細胞結(jié)果顯示，隨TGF一p:濃度加大，處于G夕GI的細胞比例逐漸增多， 而處于S期的細胞比例逐漸減少。 4.FAK原位雜交結(jié)果顯示:正常動脈在血管中膜有極少弱陽性表達， 在內(nèi)膜損傷后7天表達開始增加，并持續(xù)增多至術(shù)后4個月。應用不同濃 度的TGF一pl刺激6，卜時后
【圖文】：

J‘J.仗圖1一1原位雜交陰性對照x400加匯吏圖1一2正常血管:可見血管中膜有少量TGF一p;藍紫色弱陽性顆粒，定位于細胞核，箭頭所指為內(nèi)彈力板。x40027

原位雜交陰性對照x400
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R363

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