【摘要】：本文選擇柯薩奇病毒B4(CVB4)為研究對象,構(gòu)建了具有U6啟動(dòng)子的CVB4的P1A、P2A、P2B、P3D基因的單siRNA表達(dá)載體,在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)通過細(xì)胞病變效應(yīng)的觀察、收獲病毒的TCID50、蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)水平的測定檢測了單siRNA表達(dá)載體對CVB4的抑制作用,并檢測了轉(zhuǎn)染單siRNA表達(dá)載體后不同時(shí)間用CVB4感染細(xì)胞單siRNA表達(dá)載體對CVB4的抑制作用。在此基礎(chǔ)上,選擇可有效抑制CVB4復(fù)制的單siRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)移其表達(dá)siRNA的基因片段,構(gòu)建以CVB4 P1A、P2A為靶基因的雙siRNA表達(dá)載體pU6/d-siRNA /neo/GFP/C1A-2A,檢測雙siRNA表達(dá)載體在培養(yǎng)細(xì)胞中對CVB4的抑制作用并比較其與單siRNA表達(dá)載體抑制作用的不同。 通過尾靜脈注射法將pU6/d-siRNA /neo/GFP/C1A-2A注射入小鼠體內(nèi)24h后,腹腔注射CVB4病毒,同時(shí)設(shè)正常對照組和pU6/d-siRNA/neo/GFP/neg對照組。分別在病毒感染后3d、1w、3w、6w、8w處死小鼠,檢測小鼠的體重、血糖及小鼠胰腺組織內(nèi)CVB4抗原的表達(dá)量及小鼠胰腺的病變情況。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,構(gòu)建的CVB4的單、雙siRNA表達(dá)載體在體外培養(yǎng)細(xì)胞中可以抑制CVB4的復(fù)制;轉(zhuǎn)染后24h感染CVB4,單siRNA表達(dá)載體對CVB4的抑制作用最強(qiáng)。單、雙siRNA表達(dá)載體都可以在體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在并表達(dá)siRNA達(dá)15d以上,并且雙siRNA表達(dá)載體對CVB4的抑制作用比相同靶序列的單siRNA強(qiáng)。在CVB4感染誘導(dǎo)的IDDM小鼠模型中,雙siRNA表達(dá)載體,可以抑制CVB4的復(fù)制,減輕CVB4感染小鼠胰腺β-細(xì)胞的破壞,減輕CVB4誘導(dǎo)的IDDM癥狀或阻止其發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R373

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張鎂,劉蘇虎;小干擾RNA的設(shè)計(jì)及原理[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2005年03期

2 黃娟,姜平,顧小雪,許家榮,李玉峰;質(zhì)粒介導(dǎo)的核衣殼蛋白siRNA干擾A型流感病毒復(fù)制的研究[J];中國病毒學(xué);2005年03期

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本文編號：2692651