【摘要】： 目的 細小病毒B19(Human Parvovirus B19，以下簡稱B19)，是已知的細小病毒屬中唯一致人疾病的病毒。這一病毒廣泛存在，在我國也有較高的感染率。主要通過呼吸道、血液制品和宮內(nèi)傳播。由于宿主的免疫力和血液學(xué)的狀態(tài)不同，導(dǎo)致截然不同的臨床表現(xiàn)：在健康兒童，導(dǎo)致無害的出疹性疾病，即感染性紅斑；在成人，與一種急性多發(fā)性關(guān)節(jié)病有關(guān)；對于有潛在血液系統(tǒng)紊亂者，可誘發(fā)一過性的再障危象；對于免疫力抑制者，持續(xù)的病毒感染表現(xiàn)為再生障礙性貧血或慢性貧血；胎兒由于免疫力未成熟，更易感染B19，發(fā)生死胎、胎兒水腫和先天性貧血。B19病毒編碼兩個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)及一個主要的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)。NS1有一個高度保守的核苷三磷酸結(jié)合構(gòu)象，它對于一系列的生物學(xué)功能的發(fā)揮至關(guān)重要，在這一結(jié)構(gòu)域中發(fā)生一個氨基酸突變時，NS1的細胞毒性即喪失，提示NS1與核苷三磷酸的結(jié)合在B19誘導(dǎo)的細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。NS1能提供 第·軍巨上膏碩士膏位公上 DNA結(jié)合位點，具有 Ah酶活性、核酸結(jié)合和翻譯啟動子功能。NS蛋白 具有細胞毒性，能誘導(dǎo)細胞調(diào)亡。它的基因變異與病毒的致病力密切相關(guān)。 NS蛋白的細胞毒性與 caspase3通路誘發(fā)的細胞調(diào)亡密切相關(guān)。這一通路的 激活在 NSI蛋白誘導(dǎo)的細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。而特異性 NS蛋白抗 體可能與疾病的轉(zhuǎn)歸有關(guān)。Von Poblotzki等于 1995年成功構(gòu)建了 NS蛋白 大腸桿菌表達系統(tǒng)，，Hicks等于 1996年構(gòu)建了 NS蛋白的桿狀病毒 Hela細 胞表達系統(tǒng)，這對于進一步研究 NSI蛋白的分于生物學(xué)活性提供了可能。研 究的目的：擴增人細小病毒B19非結(jié)構(gòu)蛋白Inysl）全長基因，構(gòu)建克隆載 體及原核表達載體，誘導(dǎo)表達 NSI融合蛋白。 方法利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和分子克隆技術(shù)，從我科保存的 BIg 陽性標本 XA20中擴增 NS蛋白基因全長，構(gòu)建 NS IPGtu1七asy克隆載 體，序列經(jīng)測序分析證實正確后亞克隆于pQE30表達載體中，并轉(zhuǎn)化至M15 感受態(tài)菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達77kD的融合蛋白。 結(jié)果＊）擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果與國外標準株（AU株）對比，有一處發(fā) 生突變，第2439位堿基由T突變?yōu)镃，氨基酸由精氨酸變?yōu)榧琢虬彼幔?）構(gòu) 建了克隆載體NSI中GEM1七asy及原核表達載體 NSlpQE30，經(jīng)酶切鑒定， 證實載體構(gòu)建成功。刀表達的NSI融合蛋白經(jīng) 10％SDSPAGE電泳證實為 77kD。 結(jié)論 ＊）建立了NSI－pQE30原核表達系統(tǒng)。NSI蛋白能在大腸桿菌 中穩(wěn)定表達，其條件是：陽性克隆菌增菌2～3 ／J＼時后，IPTG濃度 lmml／L， 于 25”C誘導(dǎo) 3小時以上。（2在國內(nèi)首次獲得人細小病毒 B19 NSI蛋白融合 表達產(chǎn)物，對進一步研究NSI蛋白的生物學(xué)活性及其單克隆抗體的制備有重 要的意義。
【圖文】：

定和分析質(zhì)粒，送上海申友生物工程公司測應(yīng)用ABI100自動測序儀完成，經(jīng)名為NSI一GEM一T一easy表達載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化略選用的載體為pQE30，分子量3.4kb前有編碼6個組氨酸標簽的基因，2所示

第.軍醫(yī)大母碩士母位格文tctaaatccagtaaagagcaccaccagttatcgttagcacagtctagaacaaatagctccatgttaggatgttaaeaagtagt415圖5:xA20一Nsl全長測序結(jié)果與標準株三、xA20一NSI全長的克隆及表達載體的酶切將挑取的陽性克隆經(jīng)Bamhl、Pstl雙Nsl一poEM一T一easy及原核表達載體NSI一pQE3oo，示四
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R346

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 張國成,孫新,許東亮,采華,李飚,陳星琪;我國人細小病毒B19VP1和VP2部分基因序列測定及變異分析[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2002年04期

2 張國成，許東亮，王曉明，張笑飛，錢新宏，鄭躍杰，李飚;國人細小病毒B19感染相關(guān)疾病譜[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1999年06期

3 孫新;人細小病毒B19基因變異研究進展[J];國外醫(yī)學(xué)(流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊);1999年02期

4 范竹萍,蕭樹東,童菊芳,陳陵際,張素胤;細小病毒 H-1 抗腫瘤的實驗研究——(Ⅱ)對原位裸小鼠肝癌 HCC-93[J];腫瘤;1997年03期

5 楊有文,叢笑倩,蕭樹東;應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究細小病毒非結(jié)構(gòu)基因抗腫瘤作用[J];腫瘤;1999年01期

本文編號：2691872